使用囊性纤维化气道为例,手稿呈现全面的工作流包括宏基因组和metatranscriptomic方法的组合来表征动物相关样品中的微生物和病毒的社区。
高通量测序的访问已经彻底改变了生物学的许多领域。为了更好地了解主机相关病毒和微生物群落,全面的工作流用于DNA和RNA提取被开发了。工作流同时生成病毒和微生物宏基因组,以及metatranscriptomes,从下一代测序单个样品。这些方法的耦合提供两者的分类学特性和社区编码功能的概述。所提出的方法使用囊性纤维化(CF)的痰,一个有问题的样本类型,因为它是非常粘稠的,并含有高量的粘蛋白,中性粒细胞游离的DNA,和其他未知的污染物。这里所描述的协议针对这些问题,并成功地恢复病毒和微生物DNA以最少的人类DNA污染。为了配合宏基因组学研究中,metatranscriptomics协议进行了优化,以恢复这两种微生物和主机的mRNA包含相对少的核糖体RNA(rRNA)的序列。的数据特性的概述呈现给作为评估的方法成功的基准。额外的CF痰液样品也收集到(ⅰ)评估跨越连续七天的微生物分布的一致性单个患者中,和(ii)比较的宏基因组的方法的一致性为16S核糖体RNA基因为基础的测序。结果表明,微生物型材无抗生素扰动每日波动是最小的,并在共同的CF相关的细菌的分类学概况分别来自低渗裂解(HL)衍生的DNA所产生的16S rDNA的库和宏基因组之间高度相似。但是,从总DNA和HL-来源的DNA产生16S rDNA的分类学轮廓之间的差异表明,低渗裂解和洗涤步骤中,不仅除去来自人的DNA的受益,而且微生物衍生extracellulAR DNA可能会歪曲实际的微生物的分布。
与人体相关联的病毒和微生物群落已被广泛地研究,在过去十年中,通过测序技术1,2中的应用。该成果已使人们认识到的重要性微生物在人类健康和疾病。主要的倡议来自人类微生物项目描述的细菌(和一些古细菌)驻留在人的皮肤,并且在口服空腔,呼吸道,泌尿生殖道,和胃肠道3。通过支气管肺泡灌洗(BAL)4,5和鼻咽拭子4健康人的气道的微生物进一步的研究表明,肺可以作为环境取样装置中,导致短暂的微生物定植在呼吸道。然而,微生物定植在受损气道表面的影响,可能导致严重的和慢性肺部感染,如那些见于囊性纤维化(CF)的患者。
吨“> CF为引起的囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)的基因突变6一个致命的遗传性疾病。这些突变引起有缺陷的CFTR蛋白,这反过来影响跨越上皮的顶端表面跨上皮离子迁移的疾病影响多个器官系统,但大多数发病率和死亡率的可归因于CF肺病7时CF肺提供用于微生物建群的唯一的生态系统。在离子迁移的缺陷会导致粘液在CF气道建立,产生的微环境,包括有氧,由静态营养丰富的粘膜表面锚定微需氧和厌氧室中。这有利于环境和定殖微生物的增殖,包括病毒,细菌和真菌。急性和慢性肺部微生物感染导致恒定的,但是效果不佳的免疫反应,从而导致广泛的气道重塑,肺容量损失,最终低O2高CO2进制失败。与CF肺相关的细菌群落都使用这两种文化的依赖和文化独立的方法,其中包括使用16S核糖体RNA(rRNA)的基因测序8和猎枪宏基因组9,10得到了很好的描述。在16S rRNA基因为基础的方法能够刻画各种各样的微生物物种和捕捉群落多样性广泛的转变。然而,在其第界定社区限制(总结于CLAESSON 等,2010 11)和代谢潜力的预测被限制为已知为确定的分类单元的那些一般功能。因此,16S rRNA基因测序的方法是不够的存在于CF肺部的多种微生物群落的必要分类和功能的分析的精度。这里介绍的宏基因组方法的补充16S rRNA基因为基础的方法,克服了它的局限性,并实现了相对有效的办法分析这两种微生物群落的分类和CF肺部遗传内容。
微生物的DNA来自动物相关样品中分离往往含有大量的宿主DNA。 CF痰或肺组织样品通常含有大量的人类DNA由嗜中性粒细胞在免疫反应释放时,经常是大于99%的总DNA 12 – 14。虽然一些完整的人类细胞可以存在,最该DNA的是游离在溶液中或吸附到微生物的表面上。此外,特别粘稠粘液插头,细胞碎片和其它未知杂质的存在下进一步复杂化的微生物细胞的分离。几种方法进行了测试消耗这些样品的人类DNA,其中包括的Percoll梯度从微生物细胞15分开的人力,用DNA酶I处理,溴化乙锭单氮化物,以选择性地降解人类DNA 16和MolYsis试剂盒,都用有限的成功。迄今最有效的微生物的DNA纯化步骤的CF痰液已经由布莱滕等人所描述的方法的变形例。(1995)17。这种方法,在此被称为低渗裂解(HL)方法,使用β巯基乙醇的组合,以减少粘蛋白二硫键,真核细胞的低渗裂解和DNA酶I处理的DNA溶于9。尽管缺乏替代品的HL方法提出由于(1)有些担忧,从微生物不必要的裂解和可能导致的偏见(ii)在群落组成9,10观察到的波动是否与样品加工相关的变化的神器。除了猎枪宏基因组的产生,我们通过比较总DNA和微生物的DNA来自使用同一组来自整个连续七天单个患者采集的痰样品的HL法提取的16S rRNA基因型材解决这些问题。
ENT“>相较于微生物群落,病毒性社区与动物相关的特征是有限的18,19在CF呼吸道病毒社区只得到最低限度的特点20 – 22第一个宏基因组研究中的病毒特征社区在CF气道的DNA表明,与CF肺部相关大多数病毒是噬菌体20。噬菌体在CF和非CF个体的代谢潜力显著不同,具体地,在CF个体噬菌体群体进行基因反射细菌宿主的适应与CF气道的生理学,和在CF肺组织的病毒细菌毒力20,后续的宏基因组的研究表明解剖区域22之间的病毒群落明显的空间异质性,此外,CF肺组织窝藏最低的病毒多样性观察迄今在任何生态系统22。鉴定大多数病毒是噬菌体与潜在感染的CF病原体。然而,也发现真核病毒如疱疹病毒,腺病毒,和人乳头状瘤病毒(HPV)。在一个事件中,其中,解剖过程中观察到的肺组织囊肿,超过99%的人类乳头状瘤病毒基因组的回收,即使病人从未诊断患有肺乳头状瘤或癌。这表明病毒多样性本不仅反映组织损伤的严重程度,但也可能暴露和解释一个潜在未表征的疾病。这里描述的方案提供了一种简单而功能强大的方式来隔离从样本包括大量厚的粘液,宿主和微生物细胞,游离的DNA,以及细胞碎片的病毒样颗粒(VLPs)。宏基因组学的补充,metatranscriptomics用于整个微生物群落与宿主9,23监测基因表达的动态。在这种情况下,无论是微生物和何吨的mRNA需要被优先选择。因为细菌的mRNA聚腺苷酸化不是,一个寡-dT系的mRNA下拉方法不能被利用。聚腺苷酸化依赖性RNA扩增不能主机相关联的样本中被使用,如果将样品已知含有大量的真核mRNA的。许多动物相关的样本,包括CF痰,含有细胞的除了高含量的细胞碎片和核酸包括RNA酶的高密度。因此,另一种具有挑战性的任务是防止metatranscriptome处理期间广泛RNA降解。在大多数情况下,从CF痰提取总RNA是部分降解,限制了来自RNA的下游应用和效用。在最近几年,已经开发出并适于在可商购的试剂盒几种方法为rRNA的枯竭。这些方法的功效但是有限的,尤其是与部分降解的rRNA 9,24工作时。这里所采用的方法允许编为适于高效下游总的rRNA去除部分降解的总RNA的检索。从比较两种不同的试剂盒部分降解的总RNA中rRNA的去除效率的直接比较由Lim 等说明。(2012)9。
总体而言,本手稿的目的是提供一套完整的协议( 图1),以产生病毒和微生物猎枪宏基因组,以及一个metatranscriptome,从单一动物相关的样本,利用诱导痰样本作为一个例子。分子实验室工作流程应包括独立前和扩增后的区域,以减少交叉污染。该方法是很容易适应其他类型的样品例如组织22,鼻咽和口咽拭子25,支气管肺泡灌洗(BAL)和珊瑚(未发表数据)。每个样品应立即收集后进行处理尤其是当微生物宏基因组,并会见atranscriptomics研究是期望的。如果将样品冷冻,它限制了完整的微生物细胞的分离微生物宏基因组作为冷冻潜在破坏细胞的完整性。然而,冷冻并不排除metatranscriptomics和病毒分离,但RNA的回收可通过冻融过程受到影响病毒颗粒的质量和数量。要注意的是诱导痰一直作为样品与成人CF患者和其他慢性肺部疾病26,27相关联的BAL可太侵入性的许多研究的主要来源是重要的。在我们的研究中,痰样本,收集与一个仔细和一致的抽样方法, 例如 ,下面的漱口水,并使用无菌生理盐水溶液,以保持口腔微生物污染的痰样品到最低限度内口腔冲洗。
病毒宏基因组学
病毒颗粒是使用聚乙二醇(PEG)沉淀或小体积浓缩浓缩。在某些情况下,浓度可能并不需要,但预过滤或低速离心步骤用于除去真核生物和微生物细胞。病毒裂解液将进一步丰富和使用密度梯度离心9,41或小尺寸的过滤器( 例如 ,0.45微米),以去除真核和大微生物细胞25。纯化典型地密集,但惰性溶液如蔗糖或氯化铯以分离和浓缩的病毒颗粒41的密度梯度超离心。物理分离是基于大小和病毒颗粒的浮力密度。因此,过滤器的孔径适当选择和梯度的严谨制备是必不可少的分离特定的病毒群体,作为体力恢复的成功的VLP确定社会隔绝41(即不通过提取密度内的过滤器或下降,即 ,病毒颗粒不会在宏基因组被检测)。后的病毒分离和浓度,可能有污染的非病毒基因组物质同时存在于游离核酸和微生物和真核细胞的形式在样品中。因此,关键是要验证的病毒颗粒在样品的纯度( 图1A和1B)。甲氯仿处理通常用于裂解剩余的细胞,随后通过核酸酶处理以降解游离核酸之前的核酸提取。
一个警告,以所呈现的工作流程是使用密度梯度分离,分离病毒颗粒,因为它可能会排除包膜病毒颗粒,可能是太浮力进入CsCl梯度。另一种“包罗万象”的方法是忽略密度梯度组合通道ATION和分离从0.45微米的社区的DNA – 用氯仿和DNA酶I.这种方法处理过的滤液也适合容纳小体积的样品,如那些从拭子或血浆。然而,这可能会导致在氯仿抗性的细菌污染和较高量的DNA酶I的抗胞外DNA。
目前测序协议要求的核酸测序文库制备1毫微克至1微克即较高的DNA产量提供了测序的选择更广泛的选择。产生viromes的DNA浓度往往范围低于检测极限,以超过200毫微克/微升。回收的病毒核酸的量可能不足以直接测序文库的制备。在这种情况下,核酸扩增是必需的。接头扩增鸟枪文库(LASLs)2,42,43和基于多重置换扩增(MDA)的全基因组扩增是两个方法最常用的,以产生足够的DNA测序。丙二醛的方法,例如那些基于Phi29 DNA聚合酶是已知的,从扩增偏倚之苦,并且可以优先地扩增的ssDNA和环状DNA,产生非定量分类学和功能表征44,45。所述LASLs方法的优化版本已被证明引入只有很少的偏见,促进更高的灵敏度(对于少量的起始材料),并容易适于不同测序平台43。然而,该方法具有许多步骤,需要专门的设备,以减少DNA的损失,并且限制为双链DNA模板。在我们的实验室中,这种方法已被成功地适应于扩增的DNA,从支气管lavage-,coral-和海水衍生的VLP(未发表和Hurwitz 等。46)中提取的可检测和不可检测量。
开发数据分析管道具有CLAssically一直是病毒性宏基因组分析中最具挑战性的一个方面,由于病毒社区的高度多样化和鲜为人知的性质。虽然估计有10 8病毒基因型生物圈,迄今为止当前病毒数据库包含〜4000病毒基因组,这是该近似的总病毒多样性的约1 / 100,000。因此,基于相似性检索(如BLAST 47)的分类和功能分配在病毒宏基因组具有内在的挑战。许多序列不具有显著相似之处在数据库中的基因组,并且因此,被分类为不明。尽管同源性为基础的搜索是用于分配分类学中最重要的应用和功能的序列数据,已经开发了基于数据库独立分析的替代方法48- 50。 Fancello 等 51提供的维拉使用的计算工具和算法进行全面审查升宏基因组学。
微生物宏基因组学
通常情况下,DNA的低渗裂解处理的微生物群落(HL-DNA)萃取的总量范围为20纳克至5微克。的产率是高度依赖于病人的健康状况和痰样品的采集量,这解释见于的HL-DNA在这项研究中( 表2)中提取的总产率的变化。的关键步骤,以产生良好的质量的序列数据依靠产生测序文库的质量。 图2显示了典型的尺寸范围为使用酶基的DNA片段化过程从CF痰衍生的微生物的DNA中产生的测序文库。最优文库大小是依赖于测序平台和应用程序的选择,并且因此,分片程序可以优化,如果需要的话,通过各种途径,如超声处理和雾化。此外所提出的有代表性的结果,所提出的方法对CF痰从在多个时间点的多个患者收集的成功也示于Lim 等人(2012)9和Lim 等人。(2014)10。
以往的研究表明9,10每个病人怀有一套独特微生物群落,从而改变随着时间的推移,从而反映了社区内的主要参与者的持久性,而波动可能是由于扰动,如抗生素治疗。这些波动无论是每天发生,即使没有外部干扰或由于抽样程序和来样加工,仍然是一个问题。基于所述的HL-DNA的宏基因组和16S rDNA的扩增子的分析上,在7天的纵向取样表明微生物型材无抗生素扰动的日常波动(第1天,2和3)中的最小的( 图3A和3B)。经介绍口服抗生素duction马上第3天取样后,改变了社区概况成为第4天明显虽然抗生素环丙沙星针对已知的细菌性病原体如铜绿广谱假单胞菌 , 金黄色葡萄球菌 , 链球菌和肺炎 ,治疗增加P的相对丰度假单胞菌同时减少链球菌属 。和P.黑素 。 6日,社会慢慢恢复到初始起点群落结构。结果表明,单一患者内的微生物型材波动更可能是由于在气道社区扰动。
定的16S rDNA的库和宏基因组从HL-来源的DNA的微生物轮廓之间的一致性,我们排除了从本研究中使用的16S rRNA基因的引物起始的偏见。一个可能的解释看出整个16S rDNA序列分类的差异从总DNA和HL-衍生的DNA( 图3B)产生人型材可以是大量的假单孢菌属的存在。抗生素治疗后细胞外的DNA。这是支持的结果,这些差异是在第7天最为明显,在抗生素治疗,其靶向假单胞菌后三天。除了其他。环丙沙星是常用的第一线治疗的CF患者和慢性P.绿脓杆菌感染,尽管其活动范围包括了大部分CF相关的病原体。我们假设,抗生素治疗根除易感社区包括链球菌属 。因此创建填充性P.利基绿脓杆菌 。 绿脓杆菌可能获得抵抗通过增加其生物膜群落和细胞外的DNA已被证明是其生物膜结构52的主要结构支撑。甚至为t他群落结构恢复,外DNA可能留在CF痰。因此,这些数据表明,低渗裂解和呈现在这个工作流程中,不仅除去来自人的DNA的潜在受益的洗涤步骤,但也微生物衍生的胞外DNA,可能歪曲实际微生物轮廓。
Metatranscriptomics
高品质的metatranscriptome应包含相对较少的核糖体RNA(rRNA基因)序列和代表社会成绩单(mRNA)的一个公正的采样。由于半衰期短和有限数量的mRNA,这是至关重要的协议,如这里介绍的,最大程度地减少样品处理,以最大限度地提高转录回收的数量。
在最近几年,已经开发出并适于在可商购的试剂盒几种方法为rRNA的枯竭。这些措施包括为MicroB 充实瑞博零和样本的具体消减ħybridizations 53是基于寡核苷酸杂交,并与mRNA-ONLY试剂盒是基于含有5'单磷酸外切核酸酶活性的靶向的RNA。此外,也可几种方法表达富集,如MessageAmp II细菌试剂盒的优先polyadenylates和放大线性RNA。其中的一些方法( 例如,表达-ONLY,为MicroBË随心而MessageAmp)同时使用达到最佳效率。然而,所有这些方法的效力是有限的,以部分降解的rRNA加工特别是当,如经常在从CF样本中提取总RNA观察到。聚腺苷酸化依赖性RNA扩增,不能用于生成metatranscriptomes由两个真核和原核mRNA的。另外,该聚(A)尾加到序列可以减少的有用的序列数据的量。与均聚物延伸区域将倾向于有质量得分较低,Causing一个显著数目的读取要被过滤掉通过测序和后序软件,平均有用读取长度修剪掉聚后(A)尾将被显著54减小。
与复杂的CF微生物群落和部分降解RNA( 图4A和4C)处理,我们以前的研究表明,由瑞博零黄金套件杂交捕获方法更有效地去除人类和微生物的rRNA基因相比,使用相结合的治疗其它试剂盒9( 表3)。所得到的数据使人类宿主和微生物成绩单并发分析。取决于产量和RNA的质量,以及测序平台的最终选择,许多这些工艺包括cDNA合成步骤可以简化与测序文库生成。例如,核糖零处理的RNA可用于使metatranscriptome测序天秤里斯使用ScriptSeq RNA测序文库制备试剂盒。
动物相关社区的宏基因组分析提供了包括主机和与其相关的社区整体功能实体的一个综合表述。这里提出的工作流程是适应于各种复杂的动物相关联的样本,特别是那些含有稠粘液,高量的细胞碎片,细胞外的DNA,蛋白质和糖蛋白复合物,以及除宿主细胞至所需的病毒和微生物颗粒。即使病毒和微生物颗粒可以在每一步会丢失,颗粒的分离和纯化是必要的,以减少主机的DNA的量。而宏基因组学数据提供了研究社区的代谢潜力,metatranscriptomics通过揭示编码功能9的差异表达补充这一点。基因组学和成绩单的数据进行了全面评估,取得了新的插件ights社区相互作用的动力学和促进改善的疗法9,10,55的发展。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院(1 R01 GM095384-01)授予森林Rohwer支持。我们感谢震中,一个Illumina的公司提供早期进入瑞博零流行病学套件。我们感谢马克哈塔伊的超速离心管架的设计和生产。我们感谢安德烈亚斯·阿斯和本杰明·诺尔斯关键读数和手稿的讨论,劳伦保罗协助拍摄过程。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer | Life Technologies | 10296-028 | TRIzol LS Reagent was used in this study |
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm | Cole-Parmer | YO-36270-62 | Zirconia-Silicate Beads were used in this study |
Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder) | Promega | V3155 | Can be purchased from any other company |
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane | Millipore | SLHV033RS | |
DNase I enzyme | Calbiochem | 260913 | |
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-13 | Diameter: 25mm |
Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman | 344059 | 9/16 X 3 ½ in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation |
SW41 Ti Rotor | Beckman | 333790 | |
SS-34 Fixed Angle Rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
Phi29 DNA polymerase | Monserate Biotech | 4001 | 10 U/µl |
Phi29 Random Hexamer | Thermo Scientific | S0181 | Previously bought from Fidelity Systems |
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-34 | Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
RNase-free DNase I | NEB | M0303S | Can be purchased from any other company |
Glycogen, RNA grade | FisherScientific | FERR0551 | Can be purchased from any other company |
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes | FisherScientific | 05-562-16B | For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor |
Total rRNA removal kit | Epicentre | MRZE724 | ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation |
Cesium chloride | FisherScientific | BP1595-500 | |
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H5882-100G |