يعيش التصوير لل<em> ذبابة الفاكهة</em> العذراء العين
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
العمليات الكامنة للتنمية العذراء ذبابة الفاكهة يمكن أن تحول وتشويه ظهارة العين في السبل التي تجعل سلوك الخلية الفردية الصعب تتبع أثناء التصوير الخلية الحية. وتشمل هذه العمليات: دوران في شبكية العين، نمو الخلايا وحركة عضوي. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما طيات قدم مخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفية وكما يتم إعداد خادرة للتصوير، وجعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور أكثر من عدد قليل من ommatidia في طائرة الوصل واحدة. سير العمل أوجز هنا العلاجات هذه القضايا، مما يسمح للتحليل سهل من العمليات الخلوية خلال ذبابة الفاكهة تطوير العذراء العين. يتم ترتيب الشرانق نظموا بشكل مناسب، في تلاعب التصوير التي يمكن تجميعها بسهولة في معظم المختبرات اليوبيكويتين-DE-كادهيرين: GFP وGMR-GAL4 -driven UAS-α-كاتينين: GFP تستخدم لتصور حدود الخلية في العين ظهارة 1 -3. بعد إزالة التفاف هوتطبق على صور الفلورسنت القبض على طائرات التنسيق متعددة، يتم إنشاء القصوى الصور الإسقاط لكل نقطة زمنية وتعزيز استخدام برامج تحرير الصور. وتستخدم خوارزميات المواءمة لتحقيق الاستقرار بسرعة الحركة زائدة، مما يجعل سلوك الخلية الفردية أسهل لتتبع.
Introduction
يتميز المجمع ذبابة الفاكهة العين عن طريق ترتيب نمطي لها ~ 750 ommatidia مفصولة العسل شعرية من الخلايا الصبغية التبعي 4،5. ونمط هذه الخلايا الصبغية من قبل مجموعة منسقة من الأحداث: حركات خلية محلية، نمو الخلايا، والتغيرات في شكل الخلية، وموت الخلايا المبرمج. التصور المباشر لهذا ظهارة يسمح احد لدراسة الآليات الجزيئية التي تقوم عليها هذه الأحداث في سياق ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ورابط الجأش.
وعلى النقيض من البروتوكولات السابقة 6،7، والتقنية المذكورة هنا تتضمن وسيلة فعالة لتحقيق الاستقرار في حركة الأنسجة الغريبة التي لا يمكن أن تكون. فصل من عملية التصوير. هذه الطريقة يعزز دراسات سلوك الخلية في تطوير ذبابة الفاكهة العذراء العين ظهارة – الأنسجة التي تنمو، بالتناوب، والتحولات على مدار التصوير. وبالإضافة إلى ذلك الحركة استقرار تقنية ديمكتوب هنا سوف تكون مفيدة لدراسة الخلايا في سياقات أخرى حيث تحدث حركة دخيلة.
لتصور حدود الخلية في مجال الشبكية ذبابة الفاكهة، تم إنشاء خطوط الطيران المعدلة وراثيا التي تعبر عن يو بي آي-DE-كادهيرين: GFP وكذلك UAS-α-كاتينين: GFP تحت سيطرة السائق العين محددة GMR-GAL4 1-3. استخدام اثنين من الموسومة GFP علامات غشاء يسمح لتصور حدود الخلية في انخفاض كثافة الضوء. هذا يقلل من تلف الأنسجة وphotobleaching من على التعرض المتكرر للموجات عالية الطاقة، مما يتيح زيادة معدل الإطار، ومدة الفيلم. لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، تأسست UAS-DCR-2 أيضا في خط الطيران الثانية 8.
في التحديث الثالث من البروتوكولات السابقة، وصفت تلاعب التصوير أسهل أن يتم تجميعها بسهولة في معظم المختبرات. هذا الجهاز يغني عن اشتراط أن يكون لها ص التصوير المتخصصةIG الناتجة عن "آلة متجر" جامعة أو خدمة مماثلة. هذا تلاعب التصوير مماثلة لتلك التي تستخدم لصورة العذراء الأنسجة الأخرى 9،10.
المقدمة هنا هي الخلية الحية بروتوكول التصوير البسيطة التي يمكن استخدامها لتقييم مباشرة أحداث التخلق التي تسهم في الزخرفة العين من ~ 17-42 ساعة بعد تشكيل puparium (ساعة APF). على وجه التحديد، هذا البروتوكول يتيح احدة لتحديد الآثار المترتبة على تعديل التعبير الجيني خلال تطوير العذراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف للتنمية البرية من نوع (أعلاه) يشكل الأساس لمقارنات بين الأحداث الزخرفة في رني أو الأنماط الجينية overexpression. مقارنات التنمية الأنسجة الحية لا تقدر بثمن عند تحديد بالضبط التي تنظم سلوك الخلية عن طريق بروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، وليس وصفها هنا، تصوير الخلايا ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
