Live-avbildning av<em> Drosophila</em> PUPP Eye
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Inneboende processer av Drosophila PUPP utveckling kan skifta och snedvrida ögat epitel på ett sätt som gör enskilda cellens beteende är svårt att spåra under levande cell imaging. Dessa processer inkluderar: retinal rotation, celltillväxt och organism rörelse. Dessutom oegentligheter i topologi epitel, inklusive subtila stötar och veck ofta infördes som puppan är förberedd för avbildning, gör det svårt att förvärva i-fokus bilder av mer än ett par ommatidia i ett enda fokalplan. Arbetsflödet som beskrivs här botemedel dessa frågor, vilket möjliggör enkel analys av cellulära processer under Drosophila PUPP ögonens utveckling. Lämpligt-iscensatt puppor är anordnade i ett avbildningsrigg som lätt kan monteras på de flesta laboratorier Ubiquitin-DE-cadherin.: GFP och GMR-GAL4 driven UAS-α-catenin: GFP användes för att visualisera cellgränser i ögat epitel 1 -3. Efter dekonvolution ärtillämpas på fluorescerande bilder som tagits vid flera fokalplan, är maximal projektionsbilder genereras för varje tidpunkt och förbättras med hjälp av bildbehandlingsprogram. Inriktnings algoritmer används för att snabbt stabilisera överflödig rörelse, vilket gör individuella cellens beteende lättare att spåra.
Introduction
Föreningen Drosophila ögat kännetecknas av den stereotypa arrangemanget av dess ~ 750 ommatidia åtskilda av en bikakestruktur-gitter av accessoriska pigmentceller 4,5. Dessa pigmentceller är mönstrade med en samordnad kombination av händelser: lokala cellrörelser, celltillväxt, förändringar i cellform, och apoptos. Live visning av denna epitel gör att man kan studera de molekylära mekanismerna som ligger till grund dessa händelser i en fysiologiskt relevant och oberörd tredimensionell sammanhang.
I motsats till tidigare protokoll 6,7, den teknik som beskrivs här innefattar en effektiv metod för att stabilisera främmande vävnad rörelse som inte kan kopplas bort från avbildningsprocessen. Denna metod förbättrar studier av cellbeteende i utvecklings Drosophila PUPP ögon epitel – en vävnad som växer, roterar, och skift under loppet av avbildning. Dessutom rörelse-stabiliseringsteknik debeskrivs här kommer att vara användbart för att studera celler i andra sammanhang där främmande rörelse förekommer.
Att visualisera cellgränser i Drosophila retinal fältet, var transgena fluglinor genereras som uttrycker UBI-DE-Cadherin: GFP samt UAS-α-catenin: GFP under kontroll av ögat-drivrutin GMR-GAL4 1-3. Användningen av två GFP-märkta membranmarkörer möjliggör visualisering av cellgränser vid lägre intensitet ljus. Detta minimerar vävnadsskada och fotoblekning vid upprepad exponering för hög energi våglängder, som möjliggör ökad bildfrekvens och filmtiden. För att öka effektiviteten av RNAi transgener, UAS-DCR-2 inkorporerades också i en andra lina 8.
I en tredje uppdatering från tidigare protokoll, är en enklare bildbehandling rigg som lätt monteras i de flesta laboratorier som beskrivs. Denna apparat undanröjer kravet på att ha en specialiserad avbildning rIG genereras av ett universitet s "verkstad" eller liknande tjänst. Denna avbildning riggen är liknande den som används för att avbilda andra PUPP vävnader 9,10.
Presenterade här är en enkel live-cell bildprotokoll som kan användas för att direkt bedöma de morfogenetiska händelser som bidrar till ögat mönstring från ~ 17 till 42 h efter puparium bildning (hr APF). Specifikt möjliggör detta protokoll en att fastställa konsekvenserna av att modifiera genuttryck under PUPP utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivningen av vildtyp utveckling (ovan) utgör grunden för jämförelser av mönstring händelser i RNAi eller överuttryck genotyper. Jämförelser av levande vävnad utveckling är ovärderligt när man fast exakt vilka cell beteenden regleras av ett protein av intresse. Vidare, och inte beskrivs här, gör levande cell imaging en att göra kvalitativa och / eller kvantitativa beskrivningar av rollen av en gen av intresse för de händelser som mönster ögat. Genom 30-32 tim APF flesta pigmentceller har förvärv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
