إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em> في المختبر</em> فحوصات تكون الميالين
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
تكون الميالين هو عملية معقدة تشمل كل من الخلايا العصبية والمايلين تشكيل الخلايا الدبقية، قليلة التغصن في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وخلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية). نستخدم في المختبر تكون الميالين الفحص، وهو نموذج أنشئت لدراسة الجهاز العصبي المركزي تكون الميالين في المختبر. للقيام بذلك، يتم إضافة خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (يجد OPCs) إلى تنقية القوارض الظهرية العقدة الجذر الابتدائية (DRG) الخلايا العصبية لتشكيل myelinating المشترك الثقافات. من أجل استجواب تحديدا الأدوار التي البروتينات المحددة التي أعربت عنها قليلة التغصن تمارس عليه تكون الميالين ضعنا البروتوكولات التي تنبيغ انتقائي يجد OPCs باستخدام الفيروسة البطيئة overexpressing النوع البري والبروتينات السلبية النشطة جوهري أو المهيمنة قبل أن تبذر على الخلايا العصبية DRG. وهذا يسمح لنا لاستجواب تحديدا أدوار هذه البروتينات oligodendroglial في تنظيم تكون الميالين. ويمكن أيضا البروتوكولات تطبيقها في دراسة بعد التمديدأنواع الخلايا لها، وبالتالي توفير نهج الذي يسمح التلاعب الانتقائي للبروتينات التي أعربت عنها نوع من الخلايا المطلوبة، مثل قليلة التغصن لدراسة المستهدفة من الإشارات وآليات التعويض. في الختام، والجمع بين الفحص في المختبر تكون الميالين مع lentiviral المصابين يجد OPCs يوفر أداة استراتيجية لتحليل الآليات الجزيئية المشاركة في تكون الميالين.
Introduction
تكون الميالين من المحاور أمر بالغ الأهمية لنقل سريعة وفعالة من إمكانات العمل في كل من الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. الخلايا المتخصصة، خلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي و oligodendrocytes في الجهاز العصبي المركزي، والتفاف حولها ويغمد محاور في المايلين، وعزل فعال العصب وتسهيل التوصيل قفزي 1. ويمكن دراسة عملية تكون الميالين في المختبر باستخدام الخلايا العصبية الشبكية العقدة 2، ألياف النانو المهندسة 3، أو الخلايا العصبية العقدة الجذرية الظهرية شارك في تربيتها مع أي خلايا شوان 4 أو قليلة التغصن 5-7. في المختبر تكون الميالين الفحص هو نموذج أنشئت لدراسة العصبي تكون الميالين نظام ويعيد العديد من العمليات الأساسية التي تحدث أثناء تكون الميالين في الجسم الحي 5-8. الفحص ينطوي على coculture السكان النقي في ظهري الجذر العقدة (DRG) الخلايا العصبية، مع يجد OPCs (لCNS تكون الميالين) أو خلايا شوان (لPNS تكون الميالين). في ظل ظروف معينة هذه الخلايا myelinating يغمد محاور DRG في أمر، فائقة التحقق هيكليا، ورقة متعددة رقائقي العازلة غشاء البلازما التي تعبر عن نفس مكمل للبروتينات محددة المايلين موجودة في الجسم الحي.
نموذج خلية الأكثر استخداما لدراسة الجهاز العصبي المركزي تكون الميالين في المختبر هو المشارك الثقافات من الخلايا العصبية DRG ونسمة، والتي تم استخدامها بنجاح لدراسة تأثير تلك العوامل الخارجية مثل neurotrophins تمارس على الجهاز العصبي المركزي تكون الميالين في المختبر 5،6. العوامل الخارجية مثل عوامل النمو أو مثبطات الدوائية جزيء صغير وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة دور مسارات إشارات في تكون الميالين باستخدام DRG-OPC نموذج coculture 7،9. ومع ذلك، في إعدادات شارك في الثقافة المختلطة التي تحتوي على الخلايا العصبية و oligodendrocytes، فإنه لا يزال من الممكن رسميا إما أن عوامل النمو أو PHARمثبطات macological من الممكن أن يمارس تأثيرات على كل من الخلايا العصبية DRG و oligodendrocytes (OL). هذا لا توفر القدرة على تشريح تحديدا الأدوار التي البروتينات أعربت فقط من قبل DRGs أو دبق قليل التغصن يمارس عليها تكون الميالين باستخدام هذا النظام خلية المزدوج. لتأكيد بشكل قاطع أن مسار الإشارات في oligodendroglial ينظم تكون الميالين، تنبيغ lentiviral من نسمة، وقبل البذر على الخلايا العصبية DRG لفي المختبر تكون الميالين الفحص أثبت، ليكون وسيلة أنيقة لبإفراط على حد سواء البرية من نوع والبروتينات متحولة، فضلا مباشرة كما التعبير ضربة قاضية للبروتينات وأعرب جوهري كتبها قليلة التغصن. وهكذا فإن هذا النهج يوفر وسيلة لاستجواب تحديدا والتلاعب مسارات إشارات ضمن قليلة التغصن لدراسة تكون الميالين 9،10.
في هذه الورقة، ونحن التقرير الأساليب التي قمنا بتطويرها لبإفراط عن بروتين من الفائدة بشكل انتقائي في قليلة التغصن عبر lentiviralنهج لدراسة تكون الميالين في المختبر. تقنية تبدأ مع جيل من ناقلات التعبير التي تحتوي على الجينات في المصالح، سواء كان ذلك في نوع البرية، شكل سلبي نشط جوهري أو المهيمنة التي يتم بعد ذلك المستنسخة في وقت لاحق في pENTR ناقلات (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). هذا ناقلات (التي تحتوي على الجينات في المصالح)، يتم الجمع بين المانحين CMV PROMOTOR (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) وlentivector 2K7 في رد فعل الانزيم لإنتاج ناقلات 2K7 تحتوي على CMV المروج، الجينات في المصالح، وهو الداخلية الموقع الريباسي الدخول وGFP (الشكل 1). هذه العبارة المستنسخة بناء 2K7 جنبا إلى جنب مع المغلف فيروس PMD2.G وحزمة فيروس pBR8.91 يمكن أن يشترك transfected-إلى خلايا HEK293T لتوليد الفيروسة البطيئة التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتنبيغ يجد OPCs. مرة واحدة مصابة الفيروسة البطيئة ويجد OPCs تعبر عن مستوى عال من البروتين من الفائدة. ويمكن بعد ذلك المصنف هذه يجد OPCs على الثقافات DRG الخلايا العصبية وتأثير هذا التعبيرمستويات عالية من البروتين المطلوب تمارس على تكون الميالين يمكن استجوابه. ويتم تقييم والثقافات المشتركة للبروتين النخاعين التعبير من خلال تحليل لطخة الغربي وتصور لتشكيل قطاعات محور عصبي مياليني التي كتبها مناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكون الميالين من المحاور هي عملية حاسمة لوظيفة المثلى من كل من الجهاز العصبي المركزي والمحيطي من الفقاريات. جيل وصيانة myelinated محاور عصبية هي عملية معقدة ومنسقة تشمل التفاعلات الجزيئية بين الخلايا العصبية، الدبقية (من خلايا شوان أو قليلة التغصن) والبروتينات إضافية مص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
