생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한<em> 체외</em> 수초 분석
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
수초가 뉴런 및 신경교 세포 미엘린 형성을 모두 포함 복잡한 과정이며, 말초 신경계 (PNS)의 중추 신경계 (CNS) 및 희소 돌기 아교 세포에 슈반 세포. 우리는 시험 관내 수초 분석, 시험 관내에서 중추 신경계 수초를 연구하기위한 설립 된 모델을 사용하고 있습니다. 이를 위해서는, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (개 OPC)는 myelinating 공동 배양을 형성하는 정제 된 차 설치류 후근 신경절 (DRG) 뉴런에 추가된다. 희소 돌기 아교 세포에 의해 발현 특정 단백질이 수초에 가하는 것을 구체적 역할을 심문하기 위해 우리는 선택적 DRG 뉴런 상에 파종 전에 야생형, 구성 적으로 활성 또는 우성 네거티브 단백질을 과발현하는 렌티 바이러스를 사용하여 OPC를 형질 도입 프로토콜을 개발했다. 이것은 우리가 구체적으로 수초를 조절하는 이러한 oligodendroglial 단백질의 역할을 심문 할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 OT의 연구에 적용 할 수있다그녀의 세포 유형은, 이와 같은 시그널링 및 보상 메커니즘의 연구를위한 표적 올리고 덴드로 사이트 등의 원하는 세포 유형에 의해 발현 된 단백질의 선택적 조작을 허용하는 방법을 제공한다. 결론적으로, 렌티 바이러스 감염과 OPC에 수초 관내 분석을 결합하는 수초 형성에 관여하는 분자 메커니즘의 분석을위한 전략적인 도구를 제공한다.
Introduction
축삭 수초는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 활동 전위의 신속하고 효율적인 전송을 위해 중요하다. 전문화 된 세포, 슈반 세포는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 희소 돌기 아교 세포, 랩 어라운드 및 미엘린에 ensheathe 축삭 신경 효과적으로 절연막과 도약적인 도통 한 용이. 수초의 방법은 신경절 뉴런이 설계, 나노 파이버 3 또는 4 슈반 세포 또는 희소 돌기 아교 세포 중 5-7와 공 배양 후근 신경절 신경 세포를 사용하여 시험 관내에서 연구 될 수있다. 시험 관내 분석은 수초 신경계 수초 형성을 연구 확립 모델이며 생체 5-8에서 수초 동안 발생할 근본적인 많은 프로세스를 복제. 분석은 C에 대한 개 OPC와 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런의 정제 인구의 공 배양을, (포함NS의 수초) 또는 슈반 세포 (PNS의 수초 용). 특정 조건에서 이러한 myelinating 세포는 생체에 존재하는 수초 특정 단백질의 같은 보완을 표현 세포막을 절연의 주문, 매우 구조적으로 검증, 다중 층상 시트 DRG 축삭을 ensheathe.
시험관 내에서 CNS의 수초 형성을 연구하는 가장 일반적으로 사용되는 셀 모델이 성공적 뉴로 같은 외인성 인자는 체외 5,6에서 CNS의 수초 형성을 발휘한다는 효과를 연구하기 위해 사용되었다 DRG 뉴런 및 OPC에의 공동 배양한다. 이러한 성장 인자 또는 소분자 저해제로서 외인성 요인이 널리 DRG-OPC 공동 배양 모델을 사용하여 7,9 수초에서 신호 전달 경로의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 뉴런 및 올리고 덴드로 사이트 모두 포함하는 혼합 된 공 배양 설정에서, 그것은 정식으로 남긴 것은 가능한 성장 인자 또는 하나의 Pharmacological 억제제는 DRG 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (OL) 모두에 따라 효과를 발휘 할 수 있었다. 이것은 특히 단백질 DRGs 의해서만 표현되거나 oligodendroglia 이중 셀이 시스템을 사용하는 것이 수초에 가하는 역할을 절개하는 능력을 제공한다. 명백하게 oligodendroglial의 신호 전달 경로가 직접 체외 수초 분석에 대한 DRG 뉴런에 파종하기 전에뿐만 아니라, 야생형과 돌연변이 단백질 모두를 과발현하는 우아한 방법이 될 입증되었습니다 수초, 개 OPC의 렌티 바이러스 전달, 조절되었는지 확인하려면 희소 돌기 아교 세포에 의해 항시 적으로 발현되는 단백질의 최저 식으로. 따라서이 방법은 특히 심문과 수초 9,10 공부 희소 돌기 아교 세포 내 신호 전달 경로 조작 할 수있는 수단을 제공합니다.
본 논문에서는, 우리는 우리가 렌티 바이러스를 통해 선택적으로 희소 돌기 아교 세포에 대한 관심의 단백질을 과발현하는 개발 방법을보고체외에서 수초를 연구하기위한 방법. 기술이 관심의 유전자를 포함하는 발현 벡터의 생성으로 시작하고 후속 pENTR 벡터 (L1-L2 pENTR pENTR4IRES2GFP) 내로 클로닝 야생형, 구성 적 활성 또는 우성 네거티브 형태로 될. (관심 유전자를 포함)이 벡터는, CMV 프로모터 공여체 (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) 및 2K7의 lentivector은 CMV 프로모터 함유 2K7 벡터, 관심있는 유전자를 생산하는 효소 반응으로 결합 내부 리보좀 진입 부위와 GFP (도 1). PMD2.G 바이러스 봉투 및 pBR8.91 바이러스 패키지와 결합이 게이트웨이 클로닝 2K7 구조체는이어서 OPC를 형질 도입하는데 사용될 수 렌티 바이러스를 생성하는 HEK293T 세포로 공동 형질 감염 될 수있다. 렌티 바이러스로 감염되면 OPC에 관심 단백질의 높은 레벨을 표현한다. 이 OPC를 다음 DRG 신경 세포 배양에 접종하고 그 효과를 발현 할 수있다목적 단백질의 높은 수준은 심문 수 수초화에 미치는. 공동 문화는 웨스턴 블롯 분석에 의해 수초 단백질 발현에 대한 평가 및 면역 세포에 의해 유수 축삭 세그먼트의 형성을 위해 시각입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
축삭의 수초는 척추 동물의 중추 및 말초 신경계 양쪽의 최적의 기능을위한 중요한 과정이다. 유수 축삭의 생성 및 유지 보수와 세포 외 기질 단백질 (슈반 세포 나 희소 돌기 아교 세포)에서 분자 신경 세포 사이의 상호 작용, 아교를 포함하는 복잡하고 조정하는 과정입니다. 이 프로토콜의 의미 및 적용은 혼합 공 배양 설정 내의 하나의 특정 세포 유형에서 단백질의 조작을 허용한다는 것이다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
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