生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための<em>インビトロ</em>髄鞘形成アッセイ
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
髄鞘形成は、末梢神経系（PNS）のニューロンおよびグリア細胞を形成するミエリン、中枢神経系（CNS）におけるオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の両方を含む複雑なプロセスである。我々 は、in vitro髄鞘形成アッセイ、in vitroでのCNS ミエリン形成を研究するための確立されたモデルを使用しています。これを行うには、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）髄鞘共培養を形成するために、精製された主要なげっ歯類後根神経節（DRG）ニューロンに添加される。オリゴデンドロサイトによって発現される特定のタンパク質は、ミエリン形成の際に発揮することを、具体的な役割を調べるために、我々は選択的にDRGニューロン上に播種される前に、野生型、構成的に活性またはドミナントネガティブタンパク質を過剰発現するレンチウイルスを使用したOPCを伝達するプロトコルを開発した。これは、私たちは特に髄鞘形成の調節にこれらのオリゴデンドログリアのタンパク質の役割を調べることができます。プロトコルがotの研究にも適用することができる彼女の細胞型は、このようにしてそのようなシグナリング及び補償メカニズムの研究のための標的オリゴデンドロサイトのような所望の細胞型によって発現されるタンパク質の選択的操作を可能にするアプローチを提供する。結論として、レンチウイルスに感染したOPC を用いたin vitro髄鞘形成アッセイを組み合わせること髄鞘形成に関与する分子メカニズムの解析のための戦略的なツールを提供しています。
Introduction
軸索の髄鞘形成は、両方の中枢神経系および末梢神経系における活動電位の迅速かつ効率的な伝送のために重要である。特殊化した細胞は、シュワン細胞が中枢神経系における末梢神経系およびオリゴデンドロサイトでは、ラップアラウンドおよびミエリンでensheathe軸索、効果的に神経を絶縁し、跳躍伝導1を容易にする。髄鞘形成の過程は、網膜神経節ニューロン2、人工ナノファイバー3、またはシュワン細胞4またはオリゴデンドロサイト5-7のいずれかとの共培養後根神経節ニューロンを用いてインビトロで研究することができる。 インビトロ髄鞘形成アッセイは、神経系のミエリン形成を研究するための確立されたモデルであり、それは、生体内 5-8 のミエリン形成時に発生する基本的なプロセスの多くを複製します。アッセイは、CのためのOPCと後根神経節（DRG）ニューロンの精製集団の共培養を、（関与NSの髄鞘形成）またはシュワン細胞（PNSの髄鞘形成のため）。特定の条件下で、これらの髄鞘形成細胞は、生体内に存在するミエリン特異的タンパク質の同一の相補体を発現する形質膜の絶縁命じ、超構造的に検証され、多層のシートのDRG軸索をensheathe。
インビトロでの CNS の髄鞘形成を研究する最も一般的に使用される細胞モデルに成功などのニューロトロフィンのような外因性因子は、インビトロ 5,6 における CNS髄鞘形成に発揮することの効果を研究するために使用されたDRGニューロンおよびOPCの共培養である。そのような増殖因子または小分子薬理学的阻害剤のような外因性因子は広くDRG-OPC共培養モデル7,9を用いて、髄鞘形成におけるシグナル伝達経路の役割を研究するために使用されている。しかし、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの両方を含む混合共培養の設定で、それは正式に可能残って、成長因子またはPharのいずれかmacological阻害剤は、DRGニューロンおよびオリゴデンドロサイト（OL）の両方に効果を発揮している可能性があります。これは、具体的のみのDRGによって発現されるタンパク質またはオリゴデンドログリアは、このデュアルセルシステムを使用して、髄鞘形成の際に発揮することの役割を分析する機能を提供していますか。明確に乏突起膠細胞におけるシグナル伝達経路を直接インビトロ髄鞘形成アッセイのためのDRGニューロン上に播種する前に、同様に、野生型および変異型タンパク質の両方を過剰発現するためのエレガントな方法であることが証明された髄鞘形成、OPCのレンチウイルス形質導入、調節していることを確認するためにオリゴデンドロサイトによる構成的に発現するタンパク質のノックダウン式として。このように、このアプローチは、具体的に質問すると髄鞘9,10を研究するためのオリゴデンドロサイト内のシグナル伝達経路を操作するための手段を提供しています。
本稿では、我々は、レンチウイルスを経由してオリゴデンドロサイトに選択的に目的のタンパク質を過剰発現するように開発したメソッドを報告in vitroでの髄鞘形成を研究するためのアプローチ。技術は、目的の遺伝子を含む発現ベクターの生成で始まり、続いて、pENTRベクター（をpENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP）にクローニングされた野生型、構成的に活性またはドミナントネガティブ型であること。 （目的の遺伝子を含む）このベクターは、CMVプロモーター供与体（をpENTR L4-R1のpENTR-pDNOR-CMV）および2K7レンチベクターは、CMVプロモーターを含む2K7ベクターは、目的の遺伝子を生成するための酵素反応で合成される内部リボソーム侵入部位およびGFP（ 図1）。 PMD2.GウイルスエンベロープとpBR8.91ウイルスパッケージと組み合わせて、このゲートウェイクローニングさ2K7構築物は、その後のOPCを形質導入するために使用することができるレンチウイルスを生成するために、HEK293T細胞に同時トランスフェクトすることができる。一旦OPCは、目的のタンパク質を高レベルで発現するレンチウイルスに感染した。これらのOPCは、その後のDRGニューロン培養と効果発現が上に播種することができる所望のタンパク質の高レベルを調べることができる髄鞘形成に及ぼす。共培養は、ウェスタンブロット分析によってミエリンタンパク質の発現について評価し、免疫細胞化学によって有髄軸索のセグメントを形成するために可視化される。
Protocol
Representative Results
Discussion
軸索の髄鞘形成は、脊椎動物の中枢神経系および末梢神経系の両方の最適な機能のために重要なプロセスである。髄軸索の生成と維持管理は、神経、（シュワン細胞またはオリゴデンドロサイトから）グリアと細胞外マトリックスタンパク質との間の分子間相互作用を含む複雑かつ協調的なプロセスである。このプロトコルの重要性と適用性は、混合、共培養の設定内の1つの特定の細胞型に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
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