Produksjon og bruk av Lentivirus til Selektivt transduce Primær oligodendrocyte forløper celler for<em> In Vitro</em> myelination Analyser
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
Myelinisering er en kompleks prosess som involverer både neuroner og gliaceller som danner myelin, oligodendrocytter i sentralnervesystemet (CNS) og Schwann-celler i det perifere nervesystemet (PNS). Vi bruker en in vitro myelinisering assay, en etablert modell for å studere CNS myelinisering in vitro. For å gjøre dette, er oligodendrocyte forløperceller (OPCs) lagt til de rensede primære gnager dorsal root ganglion (DRG) nevroner å danne myelinerende co-kulturer. For å spesifikt utspørre de roller som spesielle proteiner uttrykt av oligodendrocytter utøve på myelinisering har vi utviklet protokoller som selektivt transduce OPCS hjelp av lentivirus overekspresjon villtype, konstitutivt aktive eller dominante negative proteinene før de blir sådd ut på DRG neuroner. Dette gir oss muligheten til å spesifikt avhøre rollene til disse oligodendroglial proteiner i regulering myelination. Protokollene kan også anvendes i studiet av othennes celletyper, og dermed gi en tilnærming som gjør selektiv manipulering av proteiner uttrykt av en ønsket celletype, for eksempel oligodendrocytter for målrettet studie av signal- og kompensasjonsmekanismer. Som konklusjon, som kombinerer in vitro-assay myelinisering med lentivirale infisert OPCS gir et strategisk verktøy for analyse av molekylære mekanismer som er involvert i myelinisering.
Introduction
Myelination av aksoner er avgjørende for rask og effektiv overføring av aksjonspotensialer i både sentrale og perifere nervesystemet. Spesialiserte celler, Schwann celler i det perifere nervesystemet og oligodendrocytter i sentralnervesystemet, vikle rundt og ensheathe axoner i myelin, effektivt isolerende nerve og tilrettelegging saltatory ledning 1. Prosessen med myelination kan studeres in vitro ved bruk av retinal ganglion nevroner 2, konstruerte nanofibre 3 eller dorsal root ganglion nevroner co-dyrkede med enten Schwann celler fire eller oligodendrocytter 5-7. Den in vitro myelinisering analysen er en etablert modell for å studere nervesystemet myelinisering og det replikerer mange av de grunnleggende prosesser som oppstår under myelinisering in vivo 5-8. Analysen innebærer coculture av renset bestander av Dorsal Root Ganglion (DRG) nevroner, med OPCs (for CNS myelination) eller Schwann celler (for PNS myelination). Under spesielle forhold disse myelinerende celler ensheathe DRG axoner i den bestilt, ultra strukturelt bekreftet, multi-lamellær ark av isolerende plasma membran som uttrykker den samme komplement av myelin spesifikke proteiner tilstede in vivo.
Den mest brukte cellemodell for å studere CNS myelinisering in vitro er de ko-kulturer av DRG-neuroner og OPCS, som har blitt benyttet for å studere effekten at eksogene faktorer som neurotrofinene utøve på CNS myelinisering in vitro 5,6. Eksogene faktorer som vekstfaktorer eller lavmolekylære farmakologiske inhibitorer har blitt mye brukt for å studere rollen til signalveier i myelinisering ved hjelp av DRG-OPC coculture modell 7,9. Men i de blandede innstillinger ko-kultur som inneholder både neuroner og oligodendrocytter, det forble formelt er mulig at enten vekstfaktorer eller Pharfarmakologiske hemmere kunne ha utøvet effekter på både DRG nevroner og oligodendrocytter (OL). Dette gjør tilbyr muligheten til å spesifikt dissekere de rollene som proteinene uttrykt bare av DRG eller oligodendroglia utøver på myelination bruke denne dual cellesystem. For å utvetydig bekreftet at signalveien i oligodendroglial direkte regulerer myelinisering, lentiviral transduksjon av OPCS, før såing på DRG-neuroner for in vitro assay myelinisering, har vist seg å være en elegant måte å overuttrykke både villtype og mutante proteiner, så vel som knockdown uttrykk for konstitutivt uttrykte proteiner ved oligodendrocytter. Derfor er denne tilnærmingen gir en vei å spesifikt forhøre og manipulere signalveier innenfor oligodendrocytter for å studere myelination 9,10.
I denne artikkelen rapporterer vi metoder som vi har utviklet for å overuttrykke et protein av interesse selektivt i oligodendrocytter via en lentiviraltilnærming for å studere myelinisering in vitro. Teknikken begynner med dannelsen av ekspresjonsvektorer inneholdende genet av interesse, det være seg i en vill-type, konstitutivt aktiv eller dominant negativ form som deretter blir deretter klonet inn i vektoren pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Denne vektor (som inneholder genet av interesse) er CMV promoter donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) og 2K7 lentivector kombinert i en enzymreaksjon for å produsere en 2K7 vektor inneholdende CMV-promoteren, genet av interesse, en intern ribosomalt oppføring nettstedet og GFP (figur 1). Dette Gateway klonet 2K7 konstruere kombinert med PMD2.G virus konvolutt og pBR8.91 virus pakken kan være co-transfektert inn HEK293T celler til å generere lentivirus som senere kan brukes til å transduce OPCs. Når infisert med lentivirus de OPCS uttrykke et høyt nivå av proteinet av interesse. Disse OPCs kan da bli seedet på DRG nevroner kulturer og effekten at uttrykketav høye nivåer av det ønskede protein utøver på myelinisering kan bli avlest. Co-kulturer vurderes for myelin protein uttrykk ved western blot analyse og visualisert for dannelsen myelinerte aksonale segmenter av immunocytokjemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myelinisering av aksoner er en viktig prosess for optimal funksjon av både det sentrale og perifere nervesystem hos virveldyr. Genereringen og vedlikeholdet av myelinerte aksoner er en kompleks og koordinert prosess som omfatter molekylære interaksjoner mellom neuronal, glial (fra Schwann celler eller oligodendrocytter) og ekstra cellulære matriksproteiner. Betydningen og anvendelsen av denne protokollen er at den tillater manipulering av proteiner i en bestemt celletype innenfor de blandede innstillinger co-kultur. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
