Produktion och användning av Lentivirus att selektivt omvandla Primär Oligodendrocyte prekursorceller för<em> In Vitro</em> myeline Analyser
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
Myelination är en komplex process som involverar både nervceller och myelinet bildar gliaceller, oligodendrocyter i det centrala nervsystemet (CNS) och Schwann celler i det perifera nervsystemet (PNS). Vi använder ett in vitro myelination analys, en etablerad modell för att studera CNS myelination in vitro. För att göra detta, är oligodendrocyt prekursorceller (OPCs) läggs till de renade primära gnagare dorsalrotganglia (DRG) nervceller att bilda myeliniserande samkulturer. För att specifikt förhöra de roller som särskilda proteiner som uttrycks av oligodendrocyter utövar på myelinisering har vi utvecklat protokoll som selektivt omvandla OPCs använder lentivirus överuttrycker vildtyp, konstitutivt aktiva eller dominanta negativa proteiner innan de sås på DRG nervceller. Detta tillåter oss att specifikt förhöra roller dessa oligodendrogliala proteiner i regleringen myelination. Protokollen kan också tillämpas i studiet av othennes celltyper, som ger därmed en strategi som medger selektiv manipulering av proteiner som uttrycks av en önskad celltyp, såsom oligodendrocyter för riktade studier av signalering och kompensationsmekanismer. Sammanfattningsvis kombinerar myelination analysen in vitro med lentivirala smittade OPCs ger ett strategiskt verktyg för analys av molekylära mekanismer som är involverade i myelinisering.
Introduction
Myelination av axoner är avgörande för snabb och effektiv överföring av aktionspotentialer i både centrala och perifera nervsystemen. Specialiserade celler, Schwann celler i det perifera nervsystemet och oligodendrocyter i centrala nervsystemet, linda runt och ensheathe axoner i myelin, effektivt isolerande nerven och underlättar saltatorisk ledning 1. Processen för myeline kan studeras in vitro med användning retinala ganglieneuroner 2, engineered Nano 3, eller dorsala ganglieneuroner samodlade med antingen Schwann-celler 4 eller oligodendrocyter 5-7. In vitro myelination analysen är en etablerad modell för att studera nervsystemets myelination och det replikerar många av de grundläggande processer som sker under myelinisering in vivo 5-8. Analysen innebär samodling av renade populationer av dorsalrotganglia (DRG) nervceller, med OPCs (för CNS myelination) eller Schwann-celler (för PNS myeline). Under särskilda förhållanden dessa myeliniserande celler ensheathe DRG axoner i beställda, ultra strukturellt verifieras, multi-lamellära ark av isolerande plasmamembran som uttrycker samma komplement av myelin specifika proteiner som finns in vivo.
Det mest använda cellmodell för att studera CNS myeline in vitro är meds kulturer av DRG nervceller och OPCs, som har framgångsrikt använts för att studera effekten att yttre faktorer såsom neurotrofinerna utövar på CNS myelination in vitro 5,6. Exogena faktorer såsom tillväxtfaktorer eller små molekyler farmakologiska hämmare har ofta använts för att studera vilken roll signalvägar i myelinisering använder DRG-OPC coculture modellen 7,9. Men i de blandade samodling inställningar som innehåller både nervceller och oligodendrocyter, förblev det formellt möjligt att antingen tillväxtfaktorer eller den läkegiska hämmare kunde ha utövat effekter på både DRG nervceller och oligodendrocyter (OL). Detta inte erbjuder möjligheten att specifikt dissekera de roller som de proteiner som uttrycks endast av DRG eller oligodendroglia utövar på myelinisering använda denna dubbla cellsystem. Att entydigt bekräfta att signalväg i Oligodendroglial reglerar direkt myelination, lentiviral transduktion av OPCs, före sådd på DRG nervceller för myelination analysen in vitro, har visat sig vara ett elegant sätt att överuttrycker både vildtyp och muterade proteiner, samt som knockdown uttryck av konstitutivt uttryckta proteiner genom oligodendrocyter. Således detta tillvägagångssätt ger en aveny för att specifikt förhöra och manipulera signalvägar inom oligodendrocyter för att studera myelination 9,10.
I detta papper, vi rapporterar metoder som vi har utvecklat för att överuttrycker ett protein av intresse selektivt i oligodendrocyter via en lentiviraltillvägagångssätt för att studera myelination in vitro. Tekniken börjar med genereringen av expressionsvektorer innehållande genen av intresse, vare sig det är i en vild typ, konstitutivt aktiv eller dominant negativ form som sedan klonades därefter in i pENTR vektorn (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Denna vektor (som innehåller genen av intresse), är CMV-promotorn donator (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) och 2K7 lentivector kombineras i en enzymreaktion för att producera en 2K7 vektor innehållande CMV-promotorn, genen av intresse, en intern sajt ribosomal inresa och GFP (Figur 1). Denna Gateway klonade 2K7 konstruktion i kombination med PMD2.G virushöljet och pBR8.91 viruspaketet kan samtransfekteras in HEK293T celler för att generera lentivirus som sedan kan användas för att omvandla OPCs. När smittade med lentivirus de OPCs uttrycker en hög nivå av proteinet av intresse. Dessa OPCs kan sedan sås på DRG neuron kulturer och den effekt som uttrycketav höga nivåer av det önskade proteinet utövar på myelinisering kan förfrågas. De sam-odlingar bedöms med avseende myelinproteinuttryck genom Western blot-analys och visualiseras för bildandet av myeliniserade axonal segment genom immuncytokemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myelination av axoner är en avgörande process för optimal funktion av både de centrala och perifera nervsystemet hos ryggradsdjur. Generering och underhåll av myeliniserade axoner är en komplex och samordnad process med molekylära interaktioner mellan neuronal, gliaceller (från Schwann celler eller oligodendrocyter) och extra cellulära matrixproteiner. Betydelsen och tillämpligheten av detta protokoll är att det tillåter manipulering av proteiner i en specifik celltyp inom de blandade samodling inställninga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
