라운드 창 멤브레인을 통해 마우스 내부 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법

요약

설명된 귀 후 수술 접근법은 출혈과 동물 폐사를 최소화하면서 쥐의 달팽이관 스칼라 고막으로 빠르고 직접 전달할 수 있습니다. 이 방법은 둥근 창막을 통해 출생 후 마우스에게 분자, 약리학 및 바이러스 전달을 사용하는 달팽이관 치료에 사용할 수 있습니다.

초록

감각 신경성 난청의 기능 회복을 달성하기 위해 사용되는 유전자 치료는 청력 손실에 기여하는 기본 분자 유전 메커니즘의 이해를 부여 할 것을 약속드립니다. 내이 (內耳)에 벡터의 도입은 기존의 구조에 손상을 최소화하면서 널리 달팽이관을 통해 에이전트를 배포하는 방법으로 수행해야합니다. 이 원고는 분자, 약물 및 마우스 출생 후의 일 10 라운드 창 막 (RWM)를 통해 이전에 바이러스 성 전달을 사용하여 마우스 와우 치료에 사용할 수있는 포스트 귀의 수술 방법을 설명합니다. 혈액 손실을 최소화하고 동물의 사망률을 피하면서이 수술 방법은 스칼라 고실에 신속하고 직접 전달할 수 있습니다. 이 기술은 필수적인 내부 및 중이의 구조뿐만 아니라 목 근육 완전히 청력을 유지하면서 무시할 또는 전혀 손상을 포함한다. 이 수술 기법, 소낭 glutam의 효능을 설명하기 위해3 녹아웃 (VGLUT3 KO) 마우스가 아데노 관련 바이러스 (AAV-1)를 사용하여 내 귀에 VGLUT3의 출산 후 청각 복구 선천성 청각 장애의 마우스 모델의 예로서 사용되는 수송을 먹었다.

서론

유전자 치료는 긴 유전 청력 손실에 대한 잠재적 인 치료로 제안했지만,이 지역에서의 성공은 ¹ 애매 남아있다. 현재까지 바이러스로 매개 방법론은 상대적으로 접근 할 수없는 달팽이관 내의 특정 세포 유형을 대상으로 이론적 능력 때문에 지배적했다. 모두 아데노 바이러스 (AV) 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV)는 인공 유전자 전달에 사용되어왔다. AAVs는 여러 이유로 달팽이관에서 유리하다. 그들은 복제 결핍 바이러스이고 효율적으로 신경 세포, 청력 손실의 원인의 수에 대한 중요한 목표를 포함한 다양한 종류의 세포로 형질 전환 분자를 전송할 수 있습니다. 셀에 AAV 항목은 특정 수용체 ^2에 의해 매개된다 세포 유형이되도록 형질 도입에 따라서, 특정 혈청 형의 선택은 호환되어야한다. AAVs 효과적으로 유모 ^세포를 형질 감염 ³ 및 TRA의 안정된 장기 발현 결과, 숙주 게놈 내로 통합 할nsgenic 단백질과 세포 ⁴ 표현형 변화. 이러한 모발 세포 재생 단기 애플리케이션에 반드시 유리한 반면, 장기적 발현 유전자 결함을 안정된 구조에 매우 중요하다. AAVs 임의의 인간 질병 또는 감염과 관련된 어떠한 ^5,6,7- 내이 신경 ^독성을 증명하지 않으므로....

프로토콜

참고 : NIH 윤리 지침과 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회, 샌프란시스코의 승인 프로토콜 요구 사항을 준수 모든 절차와 동물 취급.

1. 수술에 대한 동물 준비

1. 깨끗하고 전용 공간에서 수술을 수행하십시오. 수술 전에 유리 비드 살균기로 살균, 모든 수술 도구를 압력솥.
   참고 :이 프로토콜에서 출생 후의 일을 10 ~ 12 (P10-12) FVB 마우스를 사용합니다. 다양한 연령 및 생쥐 균주는 특정 프로젝트의 요구를 충족시키기 위해 사용될 수있다. 수포 뼈 어렵게 가져 오기 때문에 P40보다 오래된 마우스는 어려울 수 있습니다.
2. 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / kg), 자일 라진 하이드로 클로라이드 (10 ㎎ / kg), 및 아세 프로 마진 (/ kg 2 mg)의 혼합물을 복강 내 주사로 마우스를 마취. 동물이 더 이상 이러한 발가락 핀치와 같은 고통스러운 자극에 반응 후에 수술 준비를 시작합니다. 만약 necessarY는 원래 평면 마취제를 복원 마취제 칵테일 접종 (1/5 원래 투여) 투여.
   참고 :이 나이에 관찰 된 사망률의 대부분이 마취제 과다 복용에 의해 발생하기 때문에이 단계에서주의하십시오.
3. 동물의 깜빡임을 억제, 마취 ....

결과

기술적 특징과 인공 분자 치료 후 귀의 접근 방식의 유틸리티를 확인하려면 AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP 및 AAV2-GFP는 RWM를 통해 P10-12 마우스 내이 (內耳)에 전달했다. 이 방법은 내부 유모 세포 내에서 성공적으로 유전자 발현을 보여줍니다 (IHC) (VGLUT3 그림 1과 GFP 그림 2와 GFP 그림 3A), 외부 유모 세포 (OHC) (GFP 그림 2)와 지원 세포 (GFP 그림 2와 그림 3A) ⁽²⁶⁾ 코르티 손상의 중요한 기관이없는. 인공 전체 마운트 면역 형광 이미지 (도 2 및도 3a)에서 본 GFP를 발현하는 다른 형태의 세포 관찰 한 AAV 혈청 형의 선택은 형질 도입되는 세포 유형과 호환 가능해야한다는 것을 보여준다.도 2 및도 3a도 1을 ^(2.......

토론

본 연구에서는 상세히 복원하거나 유전자 결함에 의해 훼손되어 정상 청각 기능을 구출하기위한 목적으로, 인공 유전자 치료에 사용될 수있는 기술을 설명한다. 그것은 전형적 외상성이므로,이 방법은 인공 유전자 전달 분자 또는 기타 잠재적 인 치료 ^(30)에 안전하다. 인공 와우 치료를위한 다른 접근 방법은 복부 접근 ^(24), 마우스와 기니 돼지 cochleostomy ^{(31, 32)} 및 림프 낭 배달 ^(33)를 포함하여 설명 하였다. 우리의 경험에 의하면, 후 귀의 접근 방식은 빠르고, 간단하고, 감소 된 부상과 동물의 사망률. 또한, 포스트 귀의 접근 방식은 외상의 가능성도 줄어들고 ^{34,35,36 청각} 관련 손실 RWM의 개선 된 시각화를 제공합니다. 이 보고서는 일에 AAV1-VGLUT3의 전달을 보여줌으로써 인공 분자 치료 후 귀의 접근 방식의 기술적 측면과 유틸리티를 문서화VGLUT3 및 GFP (그림 1과 그.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민	버틀러 Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	UCSF LARC
제공 Carprofen 진통제	UCSF LARC
제공 Betadine	Betadine Puredue Pharma
덱사메타손 안과 연고 (TobraDex)	Alcon
발열 패드	Braintree scientific, inc.
25G 바늘	BD	305127
붕규산 모세관 피펫	World Precision Instruments, inc.	1B100F-4
봉합사 PDS*plus 항균	에티콘	PDP149
조직 접착제 (Vetcode)	버틀러 샤인	31477
토끼 안티-GFP 항체	인비트로젠	A11122
해부 현미경	라이카		MZ95
플레밍/브라운 마이크로피펫	Sutter Instrument Co
풀러 모델 P-97
TDT BioSig III 시스템	터커-데이비스 테크놀로지스