Kirurgisk metode til Viralt gentilførsel til muse Inner Ear gennem det runde vindues membran
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
Genterapi, der anvendes til at opnå funktionel genopretning fra sensorineural døvhed, tilsagn om at yde en bedre forståelse af de underliggende molekylære og genetiske mekanismer, der bidrager til høretab. Indførelse af vektorer i det indre øre skal udføres på en måde, der i vid udstrækning fordeler midlet hele cochlea samtidig minimere skade på de eksisterende strukturer. Dette håndskrift beskriver en post-auricular kirurgisk tilgang, der kan anvendes til mus cochlear terapi under anvendelse af molekylære, farmakologiske, og viral levering til mus postnatal dag 10 og ældre via det runde vindues membran (RWM). Denne kirurgiske tilgang muliggør hurtig og direkte levering i scala tympani samtidig minimere blodtab og undgå dyr dødelighed. Denne teknik indebærer ubetydelig eller ingen skade på væsentlige strukturer i det indre øre og mellemøret samt nakkemusklerne, mens helt bevare hørelse. For at demonstrere effekten af denne kirurgisk teknik, den vesikulær glutamspiste transportør 3 knockout (VGLUT3 KO) mus vil blive anvendt som et eksempel på en musemodel af medfødt døvhed, der genvinder høre efter levering af VGLUT3 til det indre øre ved hjælp af en adeno-associeret virus (AAV-1).
Introduction
Genterapi har længe været foreslået som en potentiel behandling af genetisk høretab, men succes på dette område har været undvigende 1. Til dato har viralt medierede metoder dominerede grund den teoretiske mulighed for at målrette specifikke celletyper inden for forholdsvis utilgængelige cochlea. Begge adenovirus (AV) og adeno-associeret virus (AAV) er blevet anvendt til cochlear genafgivelse. AAV'er er fordelagtige i cochlea for en række årsager. De er replikationsdeficiente vira og effektivt kan overføre transgene molekyler til forskellige celletyper, herunder neuroner, et vigtigt mål for en række årsager til høretab. AAV indtræden i cellen medieres af specifikke receptorer 2; Således skal valget af en bestemt serotype være forenelig med de celletyper, der skal transduceres. AAV'er kan effektivt transficere hårceller 3 og inkorporere i værtsgenomet, hvilket resulterer i en stabil, langsigtet ekspression af transgenic protein og fænotypiske ændringer i cellen 4. Mens ikke nødvendigvis fordelagtige for kortsigtede applikationer såsom hår-celle regenerering, langsigtet ekspression er meget vigtigt for stabil redning af genetiske defekter. Fordi AAV'er ikke er forbundet med nogen menneskelig sygdom eller infektion og demonstrere ingen ototoksicitet 5,6,7, de er en ideel kandidat til anvendelse i genterapi for nedarvede former for høretab 8.
Overførsel af fremmed genetisk materiale i pattedyrs indre øre ved hjælp af virale vektorer er blevet undersøgt i det seneste årti, og fremstår som en lovende teknik til behandling både genetiske og erhvervede former for høretab 9. Den cochlea er potentielt et ideelt mål for genterapi af flere grunde: 1) dens lille volumen kræver en begrænset mængde af virus nødvendigt; 2) dens relative isolation fra andre organsystemer grænser bivirkninger; og 3) dets væskefyldte kamre lette virallevering i hele labyrint 10, 11,12,13,14, 15.
Musemodeller for medfødt døvhed tillader anvendelse af mange metoder til undersøgelse for at overvåge udviklingen i det indre øre på en systematisk, replikerbar måde. Mens den lille størrelse af muse cochleae frembyder nogle kirurgisk vanskelighed musen tjener som en yderst vigtig model i studiet af genetisk høretab, med flere eksperimentelle fordele i forhold til andre arter 16. Musemodeller muliggøre vurdering af en række karakteristika ved genetisk kobling analyse, indsamling af detaljerede morfologiske observationer, og simulering patogene scenarier; som sådan, de er gode kandidater til viralt medieret genterapi. Omfattende genetiske undersøgelser af mus kombineret med den teknologiske udvikling har gjort det muligt at generere genetisk modificerede mus på en reproducerbar måde på tværs laboratorier 17,18, 19, 20,21. Furthermore, findes der talrige modeller for både erhvervet og arvet høretab fænotyper i mus, så grundig afprøvning i denne dyremodel 22, 23,24. Således korrigere hørelse ved hjælp viralt medieret genterapi i en musemodel er et passende første skridt i at finde en kur mod sygdom hos mennesker.
Vi har tidligere vist, at transgene mus, der manglede vesikulær glutamat transportør 3 (VGLUT3) fødes døve på grund af manglende glutamatfrigørelse ved IHC bånd synapse 25. Fordi denne mutation ikke fører til en primær degeneration af sansehårceller disse mutante mus er potentielt en fremragende model til at teste cochlear genterapi til medfødt høretab.
Til dato er der blevet beskrevet en række virale levering teknikker til cochlear genterapi, herunder runde vindues membran diffusion, runde vindues membran injektion og levering via en cochleostomy. Der er potenteial fordele og ulemper ved hver af disse fremgangsmåder 9.
Her rapporterer vi en kirurgisk metode til viralt gentilførsel til VGLUT3 KO mus indre øre gennem det runde vindues membran (RWM). Den post-auricular RWM injektion metode er minimalt invasiv med fremragende hørelse konservering, og er relativt hurtig. Som vi tidligere har offentliggjort, i et forsøg på at genskabe hørelsen i denne musemodel blev en AAV1 vektor bærer VGLUT3 genet (AAV1-VGLUT3) indført i cochlea af disse døve mus ved postnatal dag 12 (P! @), Hvilket resulterer i genoprettelse af at høre 26. Høring i VGLUT3 KO mus blev bekræftet ved auditiv hjernestammen respons (ABR), mens transgen proteinekspression blev verificeret ved hjælp af immunofluorescens (IF). Denne metode viser således, viralt-medieret genterapi kan korrigere en genetisk defekt, der ellers ville resulterer i døvhed.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde, vi beskriver i detaljer en teknik, der kan anvendes til cochlear genterapi, med det mål at genoprette eller redning normal auditive funktion, der kompromitteres af en genetisk defekt. Som det er typisk atraumatisk, denne fremgangsmåde er sikker for cochlear genoverførsel eller andre potentielle molekylære behandlinger 30. Andre metoder til cochlear terapi er blevet beskrevet, herunder en ventral tilgang 24, cochleostomy 31,32 og endolymfatiske sæk levering 33</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Kesser, B. W., Lalwani, A. K., Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
