שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
ריפוי גנטי, המשמש להשגת החלמה תפקודית מחירשות חושית, מבטיח להעניק הבנה טובה יותר של מנגנונים המולקולריים וגנטיים הבסיסיים שתורמים לירידה בשמיעה. מבוא של וקטורים לאוזן הפנימית חייב להיעשות באופן שמפיץ את הסוכן נרחב ברחבי השבלול תוך מזעור פגיעה במבנים הקיימים. כתב יד זה מתאר גישה ניתוחית פוסט-אוזן שיכולים לשמש לטיפול בשבלול עכבר באמצעות מולקולרי, תרופתי, ומשלוח נגיפי לעכברים לאחר הלידה יום 10 ומעלה באמצעות הקרום העגול החלון (RWM). גישה ניתוחית זו מאפשרת אספקה מהירה וישירה להלמות scala תוך מזעור אובדן דם והימנעות תמותת בעלי חיים. טכניקה זו כרוכה נזק זניח או לא למבנים חיוניים של האוזן הפנימית ואמצע, כמו גם שרירי צוואר, תוך שמירה על דיון מלא. כדי להדגים את היעילות של טכניקה ניתוחית זו, glutam לפוחיאכלתי טרנספורטר 3 נוקאאוט עכברים (VGLUT3 KO) ישמשו כדוגמא למודל עכבר של חירשות מולדת שמשחזר שמיעה לאחר הלידה של VGLUT3 לאוזן הפנימית באמצעות וירוס adeno הקשורים (AAV-1).
Introduction
ריפוי גנטי כבר הציע ארוך כטיפול פוטנציאלי לאובדן שמיעה גנטי, אבל הצלחה בתחום זה נותרת חמקמקה 1. עד כה, מתודולוגיות תיווך באופן ויראלי גברו בשל היכולת התיאורטית למקד סוגי תאים מסוימים בתוך השבלול יחסית נגיש. אדנווירוס שניהם (AV) ונגיף adeno הקשורים (AAV) היה בשימוש למסירת גן שבלול. AAVs הוא יתרון בשבלול למספר הסיבות. הם וירוסים כפולים מחסרת וביעילות יכולים להעביר מולקולות מהונדסים לתאים מסוגים שונים, כולל נוירונים, יעד חשוב למספר הסיבות לירידה בשמיעה. כניסת AAV לתוך התא מתווכת על ידי קולטנים ספציפיים 2; כך, הבחירה של סרוטיפ מסוים חייבת להיות תואמת לסוגי התאים להיות transduced. AAVs יכול למעשה transfect תאי שיער 3 ולשלב לתוך הגנום המארח, וכתוצאה מכך הביטוי של tra יציב, לטווח ארוךחלבון nsgenic ושינוי פנוטיפי בתא 4. אמנם לא בהכרח יתרון עבור יישומים לטווח קצר, כגון התחדשות שיער תאים, ביטוי לטווח ארוך הוא מאוד חשוב עבור הצלה יציבה של פגמים גנטיים. בגלל AAVs אינם משויך לשום מחלה או הדבקת בני אדם ולהפגין לא ototoxicity 5,6,7, הם מועמד אידיאלי לשימוש בריפוי גנטי לצורות ירושה של אובדן שמיעת 8.
העברה של חומר גנטי אקסוגניים לאוזן הפנימית היונקים באמצעות וקטורים ויראליים נחקרה בעשור האחרון ומסתמנת כטכניקה מבטיחה לטיפול צורות שניהם גנטיות ונרכשות של אובדן שמיעת 9. השבלול הוא פוטנציאל יעד אידיאלי לריפוי גנטי מכמה סיבות: 1) הנפח הקטן שלה מחייב כמות מוגבלת של נגיף צורך; 2) הבידוד היחסי שלה מצד מגבלות מערכות איברי אפקטים אחרים; ו 3) התאים מלא הנוזל להקל נגיפייםמשלוח ברחבי המבוך 10, 11,12,13,14, 15.
מודלים עכבר של חירשות מולדת מאפשרים שימוש בשיטות רבות של מחקר לעקוב אחר התפתחות של האוזן הפנימית באופן שיטתי, לשכפול. בעוד גודלו הקטן של cochleae עכבר זה אכן מציג קושי כירורגית, העכבר משמש כמודל חשוב ביותר במחקר של אובדן שמיעה גנטי, עם כמה יתרונות ניסיוניים על מינים אחרים 16. מודלים עכבר מאפשרים הערכה של מגוון רחב של מאפיינים באמצעות ניתוח הצמדה גנטי, אוסף של תצפיות מורפולוגיים מפורטות, ומדמת תרחישים פתוגניים; ככזה, הם מועמדים טובים לטיפול גנטי בתיווך באופן ויראלי. מחקרים גנטיים נרחבים בעכברים בשילוב עם התקדמות טכנולוגית אפשרו ליצור עכברים מהונדסים גנטי בדרך לשחזור בכל מעבדות 17,18, 19, 20,21. Furthermorדואר, קיימים מודלים רבים לרכשו שני וירשו פנוטיפים אובדן שמיעה בעכברים, המאפשרים בדיקות מחמירות במודל זה של בעלי החיים 22, 23,24. לפיכך, תיקון שמיעה באמצעות ריפוי גנטי בתיווך באופן ויראלי במודל של עכברים הוא צעד ראשון מתאים בחיפוש אחר תרופה למחלה אנושית.
הראינו בעבר כי עכברים הטרנסגניים חסרי גלוטמט שלפוחי טרנספורטר 3 (VGLUT3) נולדים חירשים בשל חוסר שחרור גלוטמט בסינפסה סרט IHC 25. בגלל מוטציה זו אינה מובילה לניוון עיקרי של תאי שיער החושיים, עכברים שעברו מוטציה אלה הם פוטנציאל מודל מצוין שבו לבחון את הטיפול גנטי שבלול לאובדן שמיעת מולד.
נכון להיום, מספר טכניקות מסירה נגיפיות לריפוי גנטי שבלול תוארו, כולל דיפוזיה עגולה חלון קרום, הזרקת חלון קרום עגולה, ומשלוח באמצעות cochleostomy. יש עוצמהיתרונות ial וחסרונות של כל אחת מהגישות האלה 9.
כאן אנו מדווחים שיטה כירורגית למסירת גן בתיווך באופן ויראלי לאוזן הפנימית VGLUT3 KO העכבר דרך הקרום העגול החלון (RWM). שיטת הזרקת RWM פוסט-אוזן היא פולשנית עם שימור שמיעה מצוין, והוא מהיר יחסית. כפי שפורסמנו בעבר, בניסיון לשחזר את השמיעה במודל עכבר זה, וקטור AAV1 נושא את גן VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) הוכנס לשבלול האוזן של עכברים החירשים אלה ביום הלידה 12 (P! @), וכתוצאה מכך שיקום שמיעת 26. שמיעה בעכברי VGLUT3 KO אומתה על ידי הבדיקה ABR (ABR), ואילו ביטוי חלבון transgene אומת באמצעות immunofluorescence (IF). מתודולוגיה זו ובכך מוכיחה כי טיפול גנטי באופן ויראלי בתיווך יכול לתקן פגם גנטי שאחרת היה גורם לחירשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו, אנו מתארים בפירוט טכניקה שיכול לשמש לריפוי גנטי שבלול, במטרה להחזיר או הצלת פונקצית שמיעה נורמלית שנפגעה על ידי פגם גנטי. כפי שהוא בדרך כלל atraumatic, גישה זו היא בטוחה להעברת גני שבלול או טיפולים מולקולריים פוטנציאליים אחרים 30. גישות אחרות לטיפול שבלול ת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Kesser, B. W., Lalwani, A. K., Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
