गोल खिड़की झिल्ली के माध्यम से माउस भीतरी कान virally मध्यस्थता जीन डिलिवरी के लिए शल्य चिकित्सा पद्धति
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
Sensorineural बधिरता से कार्यात्मक वसूली लक्ष्य को हासिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है जीन थेरेपी, सुनवाई हानि के लिए योगदान है कि अंतर्निहित आणविक और आनुवंशिक तंत्र की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए वादा किया है। भीतरी कान में वैक्टर का परिचय मौजूदा ढांचे को चोट जबकि कम से कम व्यापक रूप से कोक्लीअ भर एजेंट वितरित कि एक तरह से किया जाना चाहिए। इस पांडुलिपि आणविक, pharmacologic, और चूहों प्रसव के बाद 10 दिन और गोल खिड़की झिल्ली (RWM) के माध्यम से पुराने वायरल वितरण का उपयोग माउस कर्णावत उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक के बाद चुपचाप कान मे कहा शल्य दृष्टिकोण का वर्णन है। खून की कमी को कम करने और पशु मृत्यु दर से परहेज करते हुए इस शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण स्काला त्य्म्पनी में तेजी से और प्रत्यक्ष वितरण सक्षम बनाता है। इस तकनीक को आवश्यक भीतरी और मध्य कान की संरचना के साथ ही गर्दन की मांसपेशियों को पूर्ण सुनवाई जबकि संरक्षण के लिए नगण्य या कोई नुकसान शामिल है। इस शल्य चिकित्सा तकनीक, vesicular glutam की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए3 पीटकर (VGLUT3 को) चूहों एक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी-1) का उपयोग भीतरी कान को VGLUT3 के प्रसव के बाद सुनवाई ठीक हो जाए कि जन्मजात बहरेपन की एक माउस मॉडल का एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ट्रांसपोर्टर खा लिया।
Introduction
जीन थेरेपी लंबे आनुवंशिक सुनवाई हानि के लिए एक संभावित उपचार के रूप में सुझाव दिया गया है, लेकिन इस क्षेत्र में सफलता एक मायावी बनी हुई है। तिथि करने के लिए, virally मध्यस्थता के तरीके में अपेक्षाकृत दुर्गम कोक्लीअ के भीतर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित करने के रिप्ले की क्षमता की वजह से predominated है। दोनों एडिनोवायरस (ए वी) और एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) कर्णावत जीन डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया गया है। AAVs कारणों में से एक नंबर के लिए कोक्लीअ में फायदेमंद हैं। वे प्रतिकृति की कमी के वायरस होते हैं और कुशलता से न्यूरॉन्स, सुनवाई हानि के कारणों में से एक नंबर के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को ट्रांसजेनिक अणुओं स्थानांतरित कर सकते हैं। सेल में एएवी प्रविष्टि विशिष्ट रिसेप्टर्स 2 द्वारा मध्यस्थता है; सेल प्रकार transduced किया जा करने के साथ इस प्रकार, एक विशेष सीरोटाइप की पसंद संगत होना चाहिए। AAVs प्रभावी रूप से बालों की कोशिकाओं तीन transfect और टीआरए के स्थिर, लंबी अवधि की अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप मेजबान जीनोम में शामिल कर सकते हैंnsgenic प्रोटीन और सेल 4 में प्ररूपी परिवर्तन। ऐसे बाल-सेल उत्थान के रूप में अल्पकालिक अनुप्रयोगों के लिए जरूरी नहीं कि फायदेमंद है, जबकि लंबी अवधि अभिव्यक्ति आनुवंशिक दोष के स्थिर बचाव के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। AAVs किसी भी मानव की बीमारी या संक्रमण के साथ जुड़े हैं और कोई ototoxicity 5,6,7 का प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं, क्योंकि वे हानि 8 सुनवाई की विरासत में मिला रूपों के लिए जीन थेरेपी में इस्तेमाल के लिए एक आदर्श उम्मीदवार हैं।
वायरल वैक्टर का उपयोग स्तनधारी भीतरी कान में बहिर्जात आनुवंशिक सामग्री का स्थानांतरण पिछले दशक में अध्ययन किया गया है और नुकसान नौ की सुनवाई के आनुवंशिक और अधिग्रहण दोनों रूपों के इलाज के लिए एक आशाजनक तकनीक के रूप में उभर रहा है। कोक्लीअ संभवतः कई कारणों के लिए जीन थेरेपी के लिए एक आदर्श लक्ष्य है: अपने छोटे मात्रा की जरूरत वायरस की एक सीमित मात्रा में आवश्यक 1); अन्य अंग प्रणालियों सीमा दुष्प्रभाव से 2) अपने रिश्तेदार अलगाव; और 3) अपने तरल पदार्थ से भरे कक्षों वायरल की सुविधा केभूलभुलैया 10, 11,12,13,14, 15 भर में वितरण।
जन्मजात बधिरता के माउस मॉडल एक व्यवस्थित, replicable रास्ते में भीतरी कान के विकास पर नजर रखने के अध्ययन के कई तरीके के प्रयोग के लिए अनुमति देते हैं। माउस cochleae के छोटे आकार के कुछ शल्य कठिनाई पेश करता है, माउस अन्य प्रजातियों के 16 से अधिक कई प्रयोगात्मक फायदे के साथ आनुवंशिक सुनवाई हानि के अध्ययन में एक अत्यंत महत्वपूर्ण मॉडल के रूप में कार्य करता है। माउस मॉडल आनुवंशिक संबंध विश्लेषण, विस्तृत रूपात्मक टिप्पणियों का संग्रह है, और रोगजनक परिदृश्यों का अनुकरण के माध्यम से विशेषताओं की एक सीमा के आकलन के लिए अनुमति देते हैं; जैसे, वे virally मध्यस्थता जीन थेरेपी के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं। तकनीकी विकास के साथ संयुक्त चूहों में व्यापक आनुवंशिक अध्ययनों से यह संभव प्रयोगशालाओं 17,18, 19, 20,21 के पार एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों उत्पन्न करने के लिए बनाया है। Furthermorदोनों हासिल कर लिया और इस पशु मॉडल 22, 23,24 में कठोर परीक्षण की इजाजत दी, चूहों में सुनवाई हानि phenotypes के विरासत में मिला लिए ई, कई मॉडल मौजूद हैं। इस प्रकार, एक माउस मॉडल में virally मध्यस्थता जीन थेरेपी का उपयोग करते हुए सुनवाई को सही करने के लिए मानव रोग के लिए एक इलाज के लिए खोज में एक उपयुक्त पहला कदम है।
हम पहले vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 3 (VGLUT3) की कमी ट्रांसजेनिक चूहों की वजह से आईएचसी रिबन अन्तर्ग्रथन 25 में ग्लूटामेट रिहाई की कमी के बहरा पैदा कर रहे हैं कि पता चला है। इस उत्परिवर्तन संवेदी बालों की कोशिकाओं के एक प्राथमिक अध: पतन के लिए नेतृत्व नहीं है, क्योंकि इन उत्परिवर्ती चूहों संभावित जन्मजात सुनवाई हानि के लिए कर्णावत जीन थेरेपी का परीक्षण करने के लिए, जिसमें एक उत्कृष्ट मॉडल हैं।
तिथि करने के लिए, कर्णावत जीन थेरेपी के लिए वायरल वितरण तकनीकों का एक नंबर एक cochleostomy के माध्यम से गोल खिड़की झिल्ली प्रसार, गोल खिड़की झिल्ली इंजेक्शन, और वितरण सहित वर्णित किया गया है। प्रबल कर रहे हैंial फायदे और इन तरीकों नौ में से प्रत्येक का नुकसान।
यहाँ हम दौर खिड़की झिल्ली (RWM) के माध्यम से VGLUT3 को माउस भीतरी कान के लिए virally मध्यस्थता जीन डिलीवरी के लिए एक शल्य चिकित्सा पद्धति की रिपोर्ट। पोस्ट-auricular RWM इंजेक्शन विधि उत्कृष्ट सुनवाई संरक्षण के साथ न्यूनतम इनवेसिव है, और अपेक्षाकृत तेज है। हम पहले से प्रकाशित किया है, इस माउस मॉडल में सुनवाई बहाल करने के प्रयास में, VGLUT3 जीन (AAV1-VGLUT3) ले जाने के लिए एक AAV1 वेक्टर प्रसव के बाद 12 दिन में इन बहरा चूहों के कोक्लीअ में पेश किया गया था (पी! @), जिसके परिणामस्वरूप में 26 सुनवाई की बहाली। Transgene प्रोटीन अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) का उपयोग कर सत्यापित किया गया था, जबकि VGLUT3 को चूहों में सुनवाई, श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) द्वारा सत्यापित किया गया था। इस पद्धति इस प्रकार virally की मध्यस्थता जीन थेरेपी होगा अन्यथा बहरापन में यह परिणाम है कि एक आनुवांशिक दोष सही कर सकते हैं कि यह दर्शाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हम विस्तार से बहाल करने या एक आनुवंशिक दोष से समझौता किया है कि सामान्य श्रवण समारोह बचाव के लक्ष्य के साथ, कर्णावत जीन थेरेपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तकनीक का वर्णन है। यह आम तौर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
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