Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all'orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
La terapia genica, utilizzato per realizzare il recupero funzionale di sordità neurosensoriale, promette di concedere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e genetici alla base che contribuiscono alla perdita dell'udito. Introduzione di vettori nell'orecchio interno deve essere fatto in modo che l'agente ampiamente distribuisce tutta la coclea minimizzando lesioni alle strutture esistenti. Questo manoscritto descrive un approccio chirurgico post-auricolare che può essere utilizzato per il mouse terapia cocleare usando molecolari, farmacologico, e consegna virale per topi giorno postnatale 10 e anziani attraverso la membrana finestra rotonda (RWM). Questo approccio chirurgico consente la consegna rapida e diretta nella scala timpanica, riducendo al minimo la perdita di sangue ed evitare la mortalità degli animali. Questa tecnica comporta trascurabile o nessun danno alle strutture essenziali dell'orecchio interno e medio nonché muscoli del collo mentre tutto conservando udito. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica chirurgica, la glutam vescicolaremangiato transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) topi verrà utilizzato come esempio di un modello murino di sordità congenita che recupera l'udito dopo la consegna del VGLUT3 all'orecchio interno tramite un virus adeno-associato (AAV-1).
Introduction
La terapia genica è stato a lungo suggerito come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito genetica, ma il successo in questo settore è rimasta inafferrabile 1. Ad oggi, le metodologie viralmente mediati hanno prevalso grazie alla capacità teorica di indirizzare specifici tipi cellulari all'interno della coclea relativamente inaccessibile. Entrambi adenovirus (AV) e il virus adeno-associato (AAV) sono stati utilizzati per la consegna del gene cocleare. AAV sono vantaggiosi nella coclea per una serie di motivi. Sono virus replica-carenti e possono efficacemente trasferire molecole transgenici a diversi tipi di cellule, tra cui i neuroni, un obiettivo importante per una serie di cause di perdita dell'udito. AAV ingresso nella cellula è mediata da recettori specifici 2; pertanto, la scelta di un particolare sierotipo deve essere compatibile con i tipi cellulari da trasdotte. AAV può efficacemente trasfettare cellule ciliate 3 e incorporare nel genoma dell'ospite, conseguente, espressione stabile a lungo termine del TRAproteine nsgenic e il cambiamento fenotipico nella cella 4. Anche se non necessariamente vantaggioso per applicazioni a breve termine, come la rigenerazione delle cellule ciliate, espressione a lungo termine è molto importante per il salvataggio stabile di difetti genetici. Perché AAV non sono associati a qualsiasi malattia umana o infezione e non mostrano ototossicità 5,6,7, sono un candidato ideale per l'uso in terapia genica per forme ereditarie di perdita dell'udito 8.
Trasferimento di materiale genetico esogeno nell'orecchio interno dei mammiferi utilizzando vettori virali è stata studiata negli ultimi dieci anni e sta emergendo come una tecnica promettente per il trattamento di forme sia genetiche e acquisite di perdita dell'udito 9. La coclea è potenzialmente un bersaglio ideale per la terapia genica per diverse ragioni: 1) la sua piccolo volume richiede una quantità limitata del virus necessaria; 2) il suo relativo isolamento da altri effetti limiti organi laterali; e 3) le sue camere piene di liquido facilitano viraleconsegna in tutto il labirinto 10, 11,12,13,14, 15.
I modelli murini di sordità congenita consentono uso di molti metodi di studio per monitorare lo sviluppo dell'orecchio interno in un modo replicabile sistematica. Mentre le dimensioni ridotte del topo coclee non presenta difficoltà chirurgica, il mouse serve come modello estremamente importante nello studio della sordità genetica, con diversi vantaggi sperimentali su altre specie 16. Modelli murini consentono la valutazione di una serie di caratteristiche, attraverso analisi di linkage genetico, raccolta di osservazioni dettagliate morfologiche, e la simulazione di scenari patogeni; come tali, sono buoni candidati per la terapia genica mediata viralmente. Ampi studi genetici nei topi combinate con i progressi tecnologici hanno permesso di generare topi geneticamente modificati in modo riproducibile attraverso laboratori 17,18, 19, 20,21. Furthermore, esistono numerosi modelli sia per acquisite ed ereditarie udito fenotipi di perdita nei topi, consentendo test rigorosi in questo modello animale 22, 23,24. Così, correggendo l'udito con la terapia genica virale mediato in un modello di topo è un primo passo opportuno nella ricerca di una cura per le malattie umane.
Abbiamo precedentemente dimostrato che i topi transgenici privi di glutammato vescicolare Transporter 3 (VGLUT3) nascono sordi a causa della mancanza di rilascio di glutammato a nastro sinapsi IHC 25. Poiché questa mutazione non porta ad una degenerazione primaria delle cellule ciliate sensorie, questi topi mutanti sono potenzialmente un ottimo modello in cui sperimentare la terapia genica per cocleare sordità congenita.
Fino ad oggi, una serie di tecniche di consegna virali per la terapia genica cocleare sono stati descritti, tra andata diffusione membrana finestra, rotondo iniezione membrana finestra e distribuirla su cocleostomia. Ci sono potentivantaggi ial e svantaggi di ciascuno di questi approcci 9.
Qui riportiamo un metodo chirurgico per la consegna del gene virale mediata all'orecchio interno VGLUT3 KO mouse attraverso la membrana della finestra rotonda (RWM). Il metodo di iniezione RWM post-auricolare è minimamente invasiva con ottima conservazione dell'udito, ed è relativamente veloce. Come precedentemente pubblicato, nel tentativo di ripristinare dell'udito in questo modello di topo, un vettore che porta il gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) è stato introdotto nella coclea di questi topi sordi al giorno postnatale 12 (P! @), Con conseguente il restauro di sentire 26. Audizione in topi VGLUT3 KO è stato verificato dai uditivo risposta tronco encefalico (ABR), mentre l'espressione della proteina transgene è stata verificata mediante immunofluorescenza (IF). Questa metodologia dimostra quindi che la terapia genica mediata viralmente può correggere un difetto genetico che altrimenti provoca sordità.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, si descrive in dettaglio una tecnica che può essere utilizzato per la terapia genica cocleare, con l'obiettivo di ripristino o salvataggio normale funzione uditiva che viene compromessa da un difetto genetico. Come è tipicamente atraumatica, questo approccio è sicuro per il trasferimento di geni cocleare o altri potenziali terapie molecolari 30. Altri approcci per la terapia cocleare sono stati descritti, tra cui un approccio ventrale 24, cocleostomia 31,32 e sac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
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