Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Summary

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

A terapia genética, usada para conseguir a recuperação funcional de surdez neurossensorial, promete conceder uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas subjacentes que contribuem para a perda de audição. Introdução de vectores para o ouvido interno deve ser feito de uma maneira que largamente distribui o agente de toda a cóclea ao minimizar lesão das estruturas existentes. Este artigo descreve a abordagem cirúrgica pós-auricular que pode ser utilizado para a terapia da cóclea de rato usando molecular, farmacológica, e entrega viral para ratinhos 10 dias pós-natais e mais velhos através da membrana da janela redonda (VM). Esta abordagem cirúrgica permite a entrega rápida e directa na escala timpânica, minimizando a perda de sangue e evitar a mortalidade animal. Esta técnica envolve negligenciável ou nenhum dano às estruturas essenciais do ouvido interno e médio, bem como os músculos do pescoço, enquanto preservando totalmente a audição. Para demonstrar a eficácia da técnica cirúrgica, a glutam vesicularComeram transportador 3 nocaute (VGLUT3 KO) será utilizado como um exemplo de um modelo de ratinho de surdez congénita que recupera auditiva após a entrega de VGLUT3 para o ouvido interno utilizando um vírus adeno-associado (AAV-1).

Introduction

A terapia genética tem sido sugerida como um potencial tratamento para perda auditiva genética, mas o sucesso nesta área permaneceu uma incógnita ^1. Até o momento, as metodologias de forma viral mediadas predominaram devido a capacidade teórica para atingir tipos específicos de células dentro da cóclea relativamente inacessível. Ambos os adenovírus (AV) e vírus adeno-associado (AAV) têm sido utilizadas para a entrega de genes coclear. AAV são vantajosos na cóclea por um número de razões. São vírus deficientes na replicação eficiente e pode transferir moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluindo neurónios, um alvo importante para um certo número de causas de perda de audição. Entrada de AAV na célula é mediada por receptores específicos ^2; assim, a escolha de um serotipo particular, deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. AAV pode eficazmente transfectar células ciliadas ³ e incorporar no genoma hospedeiro, resultando em estabilidade, expressão de longo prazo do traproteína nsgenic e mudança fenotípica na célula ^4. Embora não seja necessariamente vantajoso para as aplicações de curto prazo, tais como a regeneração de células de cabelo, expressão de longo prazo é muito importante para o salvamento estável de defeitos genéticos. Porque os AAV não estão associados com qualquer doença humana ou infecção e não demonstram ^5,6,7 ototoxicidade, que é um candidato ideal para utilização na terapia de gene para formas herdadas de perda auditiva ^8.

Transferência de material genético exógeno para o ouvido interno de mamíferos utilizando vetores virais tem sido estudada ao longo da última década e está emergindo como uma técnica promissora para o tratamento de ambas as formas genéticas e adquiridas de perda auditiva ^9. A cóclea é potencialmente um alvo ideal para terapia génica, por várias razões: 1) o seu volume pequeno necessita de uma quantidade limitada do vírus necessária; 2) seu relativo isolamento de outros efeitos limites de sistemas de órgãos secundários; e 3) suas câmaras cheias de líquido facilitar viralentrega ao longo do labirinto ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Modelos de ratos com surdez congênita permitir o uso de vários métodos de estudo para monitorar o desenvolvimento do ouvido interno de uma forma sistemática, replicável. Enquanto o pequeno tamanho do rato cochleae não apresenta alguma dificuldade cirúrgica, o mouse funciona como um modelo extremamente importante no estudo de surdez genética, com várias vantagens em relação a outras espécies experimentais ^16. Modelos de ratos permitir a avaliação de um conjunto de características por meio de análise de ligação genética, a coleta de observações morfológicas detalhadas, e simulação de cenários patogénicos; como tal, eles são bons candidatos para a terapia génica mediada por vírus. Estudos genéticos extensas em ratos, combinados com os avanços tecnológicos tornaram possível gerar camundongos geneticamente modificados de forma reproduzíveis em laboratório ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermore, existem inúmeros modelos para ambas adquiridas e herdou auditivos fenótipos perda em ratos, permitindo testes rigorosos neste modelo animal ^{22, 23,24.} Assim, corrigindo audiência usando terapia genética mediada por vírus em um modelo de rato é um primeiro passo adequado na busca de uma cura para a doença humana.

Nós já mostraram que camundongos transgênicos que faltam glutamato vesicular transporter 3 (VGLUT3) nascem surdos devido à falta de liberação de glutamato na fita sinapse IHC ^25. Porque esta mutação não leva a uma degeneração primária das células sensoriais ciliadas, estes ratinhos mutantes são potencialmente um excelente modelo em que para testar a terapia genética coclear para a perda auditiva congênita.

Até à data, foram descritos um número de técnicas de entrega virais para terapia genética coclear, incluindo membrana da janela redonda difusão, injecção membrana da janela redonda, e entrega através de um cocleostomias. Existem potenteial vantagens e desvantagens de cada uma destas abordagens ^9.

Aqui nós relatamos um método cirúrgico para entrega gene viral mediada para o ouvido interno VGLUT3 KO rato através da membrana da janela redonda (VM). O método de injeção RWM pós-auricular é minimamente invasivo, com excelente preservação auditiva, e é relativamente rápido. Como já publicado anteriormente, num esforço para restaurar a audição neste modelo de ratinho, um vector que transporta o gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) foi introduzido na cóclea destes ratinhos surdos, dia pós-natal 12 (P! @), Resultando em a restauração da audição ^26. Ouvindo nos ratos VGLUT3 KO foi verificada por audiometria de tronco encefálico (ABR), enquanto que a expressão da proteína transgene foi verificada através de imunofluorescência (IF). Esta metodologia demonstra, portanto, que a terapia génica mediada por vírus pode corrigir um defeito genético que de outra forma seria resulta em surdez.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos e manejo de animais respeitadas as diretrizes de ética do NIH e requisitos protocolo aprovado do Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco. 1. Preparar o animal para a cirurgia Realizar procedimentos cirúrgicos em um espaço dedicado limpo. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, esterilizar com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia. NOTA: Neste protocolo, utilize dia pós…

Representative Results

Para verificar as características técnicas e utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP foram entregues em camundongos P10-12 ouvido interno através da VM. Esta abordagem demonstra a expressão do transgene de sucesso dentro das células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 GFP e GFP Figura 3A), células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) e células de suporte (GFP <stro…

Discussion

Neste trabalho, nós descrevemos em pormenor uma técnica que pode ser utilizada para terapia génica coclear, com o objectivo de restaurar ou resgatar função auditiva normal, que está comprometida por um defeito genético. Como é tipicamente atraumática, esta abordagem é seguro para a transferência de genes coclear ou outras terapias moleculares potenciais ^30. Outras abordagens para a terapia coclear foram descritas, incluindo uma abordagem ventral ^24, cocleostomias ^31,32 e saco …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies