Abstract
انقراض الخوف مشروط تمت دراسة على نطاق واسع في القوارض الذكور. في الآونة الأخيرة، كانت هناك عدد متزايد من الدراسات تشير إلى أن الآليات العصبية لبعض المهام السلوكية والسلوكيات استجابة مختلفة في الإناث والذكور. يمكن استخدام الإناث في الدراسات البحثية تمثل تحديا بسبب اختلاف الهرمونات الغدد التناسلية أثناء الدورة الشهرية وداقية. يصف هذا البروتوكول إجراءات راسخة التي هي مفيدة في التحقيق في دور هرمون الاستروجين في خوف توطيد الذاكرة الانقراض في إناث الفئران. المرحلة من نزو جنسي والإدارة الاستروجين الخارجية قبل التدريب الانقراض يمكن أن تؤثر استدعاء الانقراض بعد 24 ساعة. تقنية ينظف المهبل لتحديد المرحلة ودقي الموصوفة هنا الإيدز الفحص والتلاعب ركوب الدراجات بشكل طبيعي هرمونات الغدد التناسلية. استخدام هذا النموذج القوارض الأساسي قد يزيد تحدد الآليات التي هرمون الاستروجين يمكن أن تعدل الذاكرة الانقراض الخوف فيالإناث.
Introduction
ويلاحظ الفروق بين الجنسين المتأصلة عبر السلوكيات المعرفية المختلفة ونماذج التعلم في كل من البشر والقوارض. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن النساء عموما القدرات اللفظية والتفصيل المنحى أقوى، في حين أن الرجال لديهم القدرات الحيزية أفضل 1-3. قد تكون هذه الفروق بين الجنسين يرجع ذلك جزئيا إلى تأثير الهرمونات الغدد التناسلية. مستويات استراديول عالية تحسين الأداء على المهام التي تكون فيها المرأة أفضل، ولكن تسوء الأداء على المهام أن الرجال عادة صنعا 4-6. على الرغم من أن هذه الأدلة مقنعة، وقدرة محدودة على السيطرة تماما البيئات التجريبية في الدراسات الإنسانية يجعل من الصعب تحديد ما إذا كان يمكن أن تعزى هذه التأثيرات على السلوك خصيصا لالهرمونات. الدراسات على الحيوانات، في المقابل، يسمح للظروف التي تسيطر عليها بشكل كامل.
على الرغم من أن تم تحديد الآليات العصبية الأساسية من الخوف الانقراض ومدروسة في الذكور، فإنه من غير الواضح ما إذا كانتهذه الأنظمة هي نفسها في الإناث أو كيف تتغير عبر نزو جنسي. وتستخدم تكييف الخوف والانقراض على نطاق واسع النماذج السلوكية في القوارض والبشر لإجراء الدراسات المتعلقة اضطرابات القلق. وبالنظر إلى أن النساء لديهم مخاطر أعلى للاضطرابات القلق فضلا عن ارتفاع مدة وشدة أعراض 7-13، فمن الأهمية بمكان لتشمل الإناث في هذه الدراسات. ويمكن أن يعزى النقص في تمثيل الإناث في هذا البحث لتحديات المرحلة ودقي مراقبة والمحاسبة عن الآثار السلوكية الهرمونات الجنسية. المختبرات التي تقوم بفحص الإناث في هذا الصدد القضايا اللقاء الذي غالبا ما تذهب دون الإبلاغ عنها أو لم يتم وصفها في طرق دراستهم.
الأدلة الناشئة في القوارض يشير إلى أن يتم ضبط الفروق بين الجنسين في خوف الانقراض عن طريق الهرمونات الغدد التناسلية 14-18. في تكييف الخوف، ويتم تدريب الحيوانات للخوف من التحفيز معين. بعد عدد من العروض غير المدعومة منالتحفيز، والحيوانات لا تعلم للخوف من جديلة، وهي عملية تسمى الانقراض. جيدا كيف يتعلم الحيوان ويعزز الذاكرة التعلم يمكن ملاحظتها خلال اختبار استدعاء الانقراض نظرا لبعض الوقت بعد التدريب انقراض هذه المهمة. أقل التعبير الخوف أثناء استدعاء الانقراض يوضح جيد توطيد الذاكرة الانقراض. وتشير النتائج الأخيرة من مختبرنا أن هرمون الاستروجين يمكن أن تعدل توطيد الذاكرة الانقراض الخوف وتحسين استدعاء الانقراض. على وجه التحديد، إناث الفئران التي انطفأت في مقدمات الوداق، ومرحلة من مراحل نزو جنسي خلالها تعميم مستويات هرمون الاستروجين الذروة، المعرض تعزيز الاحتفاظ الذاكرة الانقراض. في المقابل، الإناث التي انطفأت في انخفاض الاستروجين عرض المرحلة تلية الوداق فقيرة نسبيا استدعاء الانقراض، والتي يمكن أن تحسن مع إدارة استراديول خارجي قبل أو مباشرة بعد التدريب الانقراض 15،16. الآليات العصبية للذاكرة الانقراض التوحيد (بما فيuding دور هرمونات الغدد التناسلية) في الإناث ليست واضحة.
في حيوانات المختبر، ويمكن التحقيق في دور الهرمونات باستخدام الغازية إجراءات الاستئصال الجراحي مثل الإخصاء واستئصال المبيض. وبعد التعافي من عملية جراحية، وغالبا ما هرمونات الغدد التناسلية التلاعب خارجيا أثناء أداء مهمة السلوكية 19. وقد قدم هذا النهج المعلومات الهامة حول الهرمونات الجنسية ومفيد لأنه يسمح للتلاعب تسيطر عليها بشكل جيد للهرمونات الغدد التناسلية (من حيث التوقيت وجرعة) 20-23. هذا النهج، ومع ذلك، لا تقييم تأثير التقلبات التي تحدث بشكل طبيعي أن تحدث في شتى أرجاء نزو جنسي كما أنها لا تمثل الحيوانات "طبيعية"، وبالتالي الحد من احتمال متعدية للدراسات الإنسانية. تم موثقة جيدا أن مستويات هرمون الجنس الأنثوي الذروة والانخفاض في مراحل محددة من نزو جنسي، والتغيرات مستقبلات هرمون الاستروجين التعبير ضمن دورة،وبعد استئصال المبيض 24. وبالتالي، هناك حاجة لإجراء دراسات على الإناث مع الغدد التناسلية سليمة وصقل تصاميم تجريبية لدراسة موثوق الآثار أن الدول عالية ومنخفضة الاستروجين قد يكون على الإناث طيلة حياتها.
يركز هذا البروتوكول على تأثير الاستروجين على أنظمة العصبية الحيوية تشارك في خوف الانقراض. فهو يصف كيفية: 1) ترصد بدقة نزو جنسي، 2) إعداد جرعات فعالة من استراديول لإدارة النظامية، و3) اتباع النموذج السلوكي الذي يتضمن تكييف الخوف والانقراض، وأذكر في ركوب الدراجات بشكل طبيعي إناث الفئران. يمكن تعديل هذا البروتوكول مع التلاعب الدوائية وأدوات أخرى الخلوية والجزيئية للمساعدة من الدراسات لفهم أفضل الفروق بين الجنسين التي لوحظت في مشروط يخشون السلوك الانقراض. لاحظ أن الإجراءات الموضحة أدناه هي تلك المستخدمة داخل المختبر لدينا، وهناك وجود عدد من الاختلافات من هذه الإجراءات طن الأدب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة الفرعية للبحوث رعاية الحيوان، والتي هي بمثابة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC) لمستشفى ماساتشوستس العام، وتكون في الامتثال مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية.
1. السكن الحيوانية والإجراءات المناولة
- ولدى وصوله، والكبار منزل سبراغ داولي الفئران الإناث حوالي 8-10 أسابيع من العمر (وزنها 200-225 ز) في مجموعات من 3-4 بوصة صناديق بلاستيكية مع أغطية فراش رقائق الخشب. المحافظة عليها على نظام غذائي من الوصول بالمال وبالشهرة أيضا الإعلان إلى تشاو والمياه و12 ساعة ضوء / دورة الظلام. ترك الفئران ليتأقلم مع ظروف السكن والحيوان منشأة مدة لا تقل عن 1 في الاسبوع.
ملاحظة: تتم جميع الإجراءات في هذه المخطوطة خلال دورة الضوء. - وبعد هذه الفترة التأقلم، والتعامل مع جميع الحيوانات لمدة 5 دقائق كل لمدة 2-3 أيام. اختيار بشكل صحيح حتى الفئران في وقت واحد (بدعم من الجذع وليس من ذيله)،عقد لهم بشكل آمن، والحيوانات الأليفة لهم خلال هذا الوقت. التعامل مع الحيوانات التي تظهر أكثر أكد ثاب، أو القلق لفترات أطول من الوقت. هل هذا لتقليل التعامل مع الإجهاد، والتي يمكن أن تؤثر على الخطوات التالية في هذا البروتوكول.
ملاحظة: عدد الأيام وكمية من التعامل مع الحيوانات يمكن أن تختلف بين المختبرات المختلفة الزمن؛ ومع ذلك، ينبغي أن تكون هذه متسقة بين التجارب داخل نفس المختبر.
2. رصد نزو جنسي: المهبلية المسحة رتوش وتلطيخ الداخلي
- جعل 0.9٪ محلول ملحي (كلوريد الصوديوم الذائب في الماء المقطر). بلل قضيب من القطن ذات الرؤوس في هذا الحل. صمة عار طرف باستخدام منشفة ورقية لتجنب oversaturation، مما قد يؤدي إلى عدم كفاية جمع أو فقدان الخلايا العينة. عقد الذيل إلى أعلى بعيدا عن فتحة المهبل، إدراج بلطف غيض القطن في القناة المهبلية ولفة حول الجدران لالتقاط خلايا المهبل فضفاضة.
- إذا يبول الحيوان على السريرطن طرف، مع استبدال واحدة جديدة، وتلوث البول سيجعل من الصعب على تحديد المرحلة. كن حذرا للغاية حتى لا تسبب الضيق للحيوان أثناء هذا الإجراء بسبب التعرض للإجهاد سوف يعطل نزو جنسي. عندما ينظف، نهدف إلى تحقيق الإدراج السريع والانسحاب ليست عميقة جدا لتقليل تحفيز اضافي لعنق الرحم، والتي يمكن أن تحدث حمل كاذب.
يمكن التعرف على حمل كاذب باعتبارها دورة اللاحلقية داقية الذي يستمر عادة لمدة 12 يوما، أي أيام متتالية من هجوع الودق 25: ملاحظة. - إزالة بعناية طرف قضيب ولفة على شريحة المجهر وصفت مسبقا. تجنب الضغط على أسفل من الصعب جدا كما الكثير من السوائل على الشريحة يمكن أن تجعل من الصعب تحديد المرحلة مرة واحدة جافة.
ملاحظة: واحد الشريحة يمكن أن تحتوي عدة أيام لكل حيوان، على الرغم من أن هذا يمكن أن يتم وفقا لتفضيلات الفردية. - تأكد من نقل العينة على الشريحة. جمع عينات لسيفرآل أيام متتالية على شريحة واحدة لتكون قادرة على أفضل مسار وتحديد اليومية مراحل داقية التغييرات.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، كما أنها مثالية إذا الشعب جمع عينات لا تزال هي نفسها لجميع الحيوانات. - مرة واحدة الشريحة جافة، تبدأ بروتوكول تلطيخ لتحديد المرحلة. استخدام عدة تلطيخ (انظر جدول المواد)، تزج الشرائح 10 مرات في تثبيتي (الضوء الأزرق)، 10 مرات في حل وصمة عار (الوردي)، و 5 مرات في حل مباين (اللون الأرجواني). شطف الشرائح بلطف تحت الماء الجاري. السماح الشرائح تماما الهواء الجاف قبل عرض تحت المجهر.
ملاحظة: تتكون دورة طويلة وداقية عادة 4-5 يوم (بهذا الترتيب): شبق (E)، تلية الوداق (M)، هجوع الودق (D)، ومقدمات الوداق (P) 26. يتميز شبق من قبل، وخلايا متقرن الزرقاء، تلية الوداق من قبل الكريات البيض ومزيج من خلايا متقرن والأنوية، هجوع الودق هو مماثل لتلية الوداق في وجود أنواع الخلايا باستثناء أنهم متفرق جدا، ومقدمات الوداق من قبل المجاميع الأرجواني الملطخةخلايا الأنوية (الشكل 1). هناك إجراءات تلطيخ المختلفة، بالإضافة إلى تلك المذكورة أعلاه، التي هي نفس القدر من الفعالية لالمهبلية علم الخلايا تشويه. - جمع العينات لمدة سنتين على الأقل دورات كاملة (~ 8-10 أيام) من أجل رصد المراحل بدقة قبل التجريب. أن تكون متسقة مع الوقت من اليوم وتؤخذ العينات. جمع عينات مسحة المهبل يوميا في جميع أنحاء وحتى نهاية التجربة.
3. قبل التعرض
- قبل بدء التجربة، قبل فضح الحيوانات إلى تكييف غرف تسمح للحيوانات حتى يتأقلم مع السياق (غرف تكييف) قبل أي اختبار السلوكي.
- قبل فضح الإناث إلى غرف تكييف (الموجود في مربعات تخفيف الصوت) مع أضواء المنزل لمدة 20-30 دقيقة يوميا لمدة 3 أيام قبل أي التجريب. تعيين مربع أنهم باسم الغرفة الخاصة لدراسة تتعرض مسبقا. ر نظيفة تماماانه صناديق (الجدران وصواني) بين الدورات، والحيوانات لإزالة الروائح لأنها يمكن أن تؤثر على السلوك ونزو جنسي.
4. يوم 1: التعويد / تكييف الخوف
- مرة واحدة وقد تم التحقق من الحيوانات ليكون في مرحلة الشياع من دوراتها داقية، وتبدأ مرحلة التعود / تكييف التجربة لمدة 3 أيام.
- خذ ما قبل هجة تدابير أساسية من التجمد (CS) العروض السابقة لهجة الأولى مكيفة التحفيز على كل يوم من التجربة. القيام بذلك عن طريق الحصول على عشرات المئة تجميد (بقسمة ثواني قضى متحرك قبل مدة من المحاكمة، مضروبا 100) أثناء الفاصل الزمني التحفيز غائبا الوقت في بداية أول CS-حدها المحاكمة قبل بداية CS.
ملاحظة: يمكن استخدام هذه التدابير لتقييم ومقارنة مستويات تجميد أساسية مع تلك خلال التعود، تكييف، الانقراض، والتذكير. - لإجراء تدريب الانقراض خلال المرحلة تلية الوداق،شرط الفئران في اليوم الأخير من للشبق. مسحة وتحديد المرحلة داقية (الخطوة 2) كل يوم قبل بدء بروتوكول تجريبي (تكييف / الانقراض / استدعاء). وبما أن المرحلة شبق قد تستمر لفترة أطول من يوم واحد، واستخدام دورة التاريخ للتنبؤ طول مراحل لتحديد متى الحيوانات جاهزة لبدء التدريب.
- خذ ما قبل هجة تدابير أساسية من التجمد (CS) العروض السابقة لهجة الأولى مكيفة التحفيز على كل يوم من التجربة. القيام بذلك عن طريق الحصول على عشرات المئة تجميد (بقسمة ثواني قضى متحرك قبل مدة من المحاكمة، مضروبا 100) أثناء الفاصل الزمني التحفيز غائبا الوقت في بداية أول CS-حدها المحاكمة قبل بداية CS.
- في غرف تكييف، قم بتوصيل القدم صدمة الطابق الشبكة لمولد التحفيز الكهربائي. استخدام مستوى التحفيز من 0،5-0،6 مللي أمبير كما التحفيز دون شروط (US). استخدام كيلوهرتز 4، 80 ديسيبل لهجة كما المثير الشرطي (CS).
ملاحظة: قد تختلف هذه المعلمات عبر المختبرات ويجوز تعديلها للتكييف الأمثل.- إذا تطلب البرنامج تحليل تجميد الإشارات البصرية (على العكس من الزمانية)، وشارك في تفعيل ضوء LED مع لهجة. وضع ضوء على السطح الخارجي للغرفة استثابي، في إطار الفيديو. في بداية كل محاكمة، وتفعيل ضوء LED والحفاظ عليه مضاءة حتى نهاية تشرينالبريد المحاكمة.
ملاحظة: هذا الضوء هو غير مرئي من قبل الحيوان ويخدم فقط كعلامة لبدء ونهاية المحاكمة داخل ملفات الفيديو المسجلة (لاستخدامها لقياس السلوك التجميد).
- إذا تطلب البرنامج تحليل تجميد الإشارات البصرية (على العكس من الزمانية)، وشارك في تفعيل ضوء LED مع لهجة. وضع ضوء على السطح الخارجي للغرفة استثابي، في إطار الفيديو. في بداية كل محاكمة، وتفعيل ضوء LED والحفاظ عليه مضاءة حتى نهاية تشرينالبريد المحاكمة.
- وضع الحيوانات في غرف تكييف لمدة 5 محاكمات CS-حدها من التعود. عقب الجلسة التعود على الفور، نفذ 7 محاكمات CS-الولايات المتحدة تقرن تكييف الخوف. تأكد من أن لهجة CS يستمر لمدة 30 ثانية وcoterminates مع صدمة 0.5 ثانية في الولايات المتحدة. تجارب تشغيل في جميع الدورات (التعود، تكييف، الانقراض، وأذكر) مع فاصل زمني intertrial متغير في المتوسط 3 دقائق.
- في نهاية الدورة تكييف، والعودة إلى أقفاص الحيوانات وطنهم وإلى مرفق الحيوان حتى اليوم التالي.
5. يوم 2: إعداد استراديول
- مسحة وتحديد المرحلة داقية لجميع الحيوانات التي خضعت ليوم 1 من هذا البروتوكول. إعداد استراديول (المعروف أيضا باسم E2، 17beta استراديول، أوبيتا استراديول) لمدة 15 ميكروغرام / كغ جرعة الحقن تحت الجلد باستخدام زيت السمسم أو 0.9٪ المالحة كما السيارة.
- لحساب كمية استراديول للتحضير للحقن، استخدم وزن الجسم من جميع الحيوانات، والتي تم قياسها وتسجيلها عندما كانوا مكيفة في يوم 1 من هذا البروتوكول.
- إجراء حسابات لتوحيد حجم تدار من استراديول (أي 0.2 مل) في الفئران. منذ استراديول من الصعب حل بسبب الصلابة المياه، ويتطلب كمية كبيرة من المذيبات لجرعة صغيرة، وإعداد محلول المخزون عن طريق خلط استراديول في زيت السمسم على نار حتى يذوب. ومن ثم يمكن تمرير حل من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة الملوثات. على سبيل المثال، إضافة حجم المحسوب ل/ 1 مل من محلول الأسهم زيت السمسم 3،000 ميكروغرام استراديول لإجمالي كمية المطلوبة من زيت السمسم من أجل تحقيق 15 ميكروغرام / كغ جرعة في حجم 0.2 مل حقن لكل حيوان.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم أشكال أخرى من هرمون الاستروجين ثا ر هي المياه القابلة للذوبان وأسهل حل.
6. يوم 2: إدارة استراديول / الانقراض التدريب
- إدارة تحت الجلد استراديول. رفع الجلد فضفاض بين لوح الكتف من الرقبة في السؤال لطيف وإدراج إبرة حقنة في المثلث الذي يتكون من طيات الجلد.
- 30 من زمن المباراة بعد الحقن تحت الجلد من استراديول، ووضع الحيوانات في غرف تكييف مرة أخرى ويبدأ التدريب الانقراض. في هذه الدورة الانقراض، تنفيذ 20 تجربة CS-حدها، مع كل محاكمة يتكون من 30 ثانية، و 4 كيلو هرتز، 80 ديسيبل لهجة، وقدمت في فترة intertrial متغير في المتوسط 3 دقائق.
ملاحظة: تأثير استراديول على استدعاء يحدث عندما تدار استراديول قبل التدريب الانقراض أو مباشرة بعد انقراض. ولم يلاحظ تأثير 4 ساعات بعد الانقراض، لذلك فمن المستحسن لحقن قريبة في الوقت المناسب لبداية أو نهاية الدورة التدريبية 15.
- 24 ساعة بعد التدريب الانقراض، مسحة الحيوانات التي أنجزت يوم 1 و 2 من هذا البروتوكول.
- وضع الحيوانات في غرف تكييف المسندة إليها (نفس يوم 1 و 2). بدء جلسة استدعاء الانقراض من خلال تقديم 3 محاكمات CS-حدها (المحاكمات الثلاث من استدعاء الانقراض)، الذي يتكون من فقط 3.80 ديسيبل محاكمات CS-حدها مع فترات intertrial مماثلة ل20 محاكمات تدار للتدريب الانقراض كما هو موضح في الخطوة 6.2.
- عند الانتهاء من الدورة استدعاء، والعودة إلى أقفاص الحيوانات وطنهم.
8. تحليل البيانات
- الحصول على البيانات السلوكية من خلال الفيديو وتحليلها باستخدام برامج الكمبيوتر.
ملاحظة: يمكن أيضا تجميد عشرات تحسب من قبل المجرب الذي هو أعمى إلى العلاج من تعاطي المخدرات عن طريق توقيت نوبات تجميد أثناء العرض CS كل محاكمة يدويا، معبرا عنه كنسبة مئوية من الوقت الذي يقضيه تجميد خلال لهجة. تجميد هوالتي يحددها انعدام تام للحركة باستثناء التنفس أثناء المحاكمات 30 ثانية CS-الولايات المتحدة. حساب في المئة تجميد بقسمة ثواني قضى التجمد (متحرك) من خلال 30 ثانية (مدة المحاكمة) مضروبا في 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا الخوف الانقراض بروتوكول التذكير، وقد تم قياس المئة تجميد كمؤشر على الخوف. أظهرت الحيوانات التي انطفأت بشكل جيد واحتفظت الذاكرة من التدريب الانقراض الخوف منخفض في اليوم الأخير من الاختبارات السلوكية خلال استدعاء الانقراض. الفئران الذكور والإناث لا تختلف كثيرا في التعبير مشروط الخوف خلال تكييف، الانقراض، ويتذكر مراحل (الشكل 2). ومع ذلك، يصبح الفرق الجنس واضحا عندما يتم تحليل الحيوانات بشكل منفصل عن مجموعات المرحلة داقية العالية والمنخفضة للاستروجين. إناث الفئران التي تخضع لتدريب الانقراض خلال المرحلة تلية الوداق انخفاض الاستروجين من نزو جنسي لا يتذكر الذاكرة الانقراض في اليوم 3 وكذلك تدريبهم في مقدمات الوداق (الشكل 3). هذه الإناث تلية الوداق أيضا يحمل أكبر بكثير الانتعاش الخوف أثناء استدعاء الانقراض (ضعف الذاكرة الانقراض) مقارنة بالذكور. ومع ذلك، عندما الإناث تلية الوداق هي injec تحت الجلدتيد مع 15 ميكروغرام / كغ جرعة من استراديول قبل التعلم الانقراض، يظهر ترسيخ ذاكرة الخوف الانقراض إلى تعزيز كما يتضح من انخفاض تجميد خلال استدعاء الانقراض (الشكل 4). لذلك، وهذه البيانات تشير إلى أن هرمونات الغدد التناسلية يمكن أن تعدل استدعاء الخوف الانقراض وكذلك التوسط الفروق بين الجنسين في مشروطة السلوكيات الخوف الانقراض.
الشكل 1: صور الممثل من أنواع الخلايا عبر مراحل نزو جنسي (التكبير 20X) يتميز مقدمات الوداق من قبل جماهير، الخلايا الظهارية الأنوية الأرجواني الملطخة مستديرة. شبق يمكن تحديدها من قبل مجاميع من الخلايا الحرشفية متقرن الزرقاء الملطخة. تلية الوداق وهجوع الودق تعبير عن مزيج من أنواع الخلايا (كريات الدم البيضاء، والخلايا الأنوية ومتقرن) ولكن تظهر خلايا أقل. مستويات هرمون الاستروجين تتقلب طوال مراحل داقية، وتبلغ ذروتها خلال مقدمات الوداق. (الأرصاد = تلية الوداق... ديست = هجوع الودق؛ Proest = مقدمات الوداق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة بين الذكور والإناث عبر المراحل الثلاث من التجربة لا توجد فروق الجنس كبيرة لوحظت في التعود (. هب)، تكييف (. كوند)، الانقراض، أو يتذكر مراحل التجربة 15.
الشكل (3): الاختلافات السلوكية بين مقدمات الوداق (الاستروجين عالية) وتلية الوداق (منخفض الاستروجين) الإناث الإناث في ارتفاع للاستروجين المرحلة مقدمات الوداق س.و الخوف دورة المعرض ودقي أقل من تلك الموجودة في تلية الوداق منخفضة الاستروجين. وتشير هذه البيانات إلى أن مستويات هرمون الاستروجين عند الإناث ركوب الدراجات بشكل طبيعي يمكن أن تؤثر في توطيد الذاكرة الخوف الانقراض، تحوير استدعاء 24 ساعة في وقت لاحق 15.
الشكل 4: العلاج هرمون الاستروجين عند الإناث تلية الوداق. إدارة استراديول 30 دقيقة قبل التدريب الانقراض (السهم) يسهل استدعاء الانقراض بالمقارنة مع السيارة 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تمت دراسة الخوف الانقراض على نطاق واسع في ذكور الفئران مع الآليات العصبية التوسط مشروط الانقراض الخوف تحديدها وتقييمها في إطار مختلف التلاعب. وقد درست عدد قليل نسبيا من الدراسات إناث الفئران أو دور هرمونات الغدد التناسلية في خوف الانقراض. لدراسة تحديدا آثار هرمون الاستروجين على الخوف الانقراض، يتعرضون ركوب الدراجات بشكل طبيعي إناث الفئران إلى نموذج سلوكي لمدة ثلاثة أيام. ويتكون هذا الإجراء من مراحل التعود / تكييف، الانقراض، وانقراض التذكير. باستخدام هذا البروتوكول، وقد ثبت أن إناث الفئران المدربة بالانقراض خلال المنخفضة للاستروجين المرحلة تلية الوداق معرض العالي تجميد (أو ضعاف استدعاء الانقراض) مقارنة مع الإناث التي انطفأت في مقدمات الوداق عالية للاستروجين 15. إدارة استراديول قبل التدريب الانقراض خلال المرحلة تلية الوداق ينظم توطيد الذاكرة الانقراض 16. ويتضح ذلك من انخفاض في التجميدز خلال استدعاء الانقراض. معا، وتبرز هذه النتائج على أهمية إجراء دراسات الإناث مع الانتباه إلى تأثير هرمونات المبيض ونزو جنسي على السلوك. على الرغم من أن التجارب السيطرة لم يتم وصفها هنا، سيكون من الضروري لتشمل الضوابط المناسبة، أي توجد مجموعات الانقراض، لمواصلة تقييم تأثير الاستروجين على العمليات التي ينطوي عليها توحيد الذاكرة الانقراض.
والغرض من هذا البروتوكول ذو شقين: 1) للتحقيق في آثار هرمون الاستروجين على مكيفة الانقراض الخوف خلال مراحل معينة من نزو جنسي في الحيوانات سليمة، و 2) لدراسة كيفية حادة استراديول استبدال أثناء الأنثى منخفضة عادة الدولة هرمون الاستروجين يمكن أن تعدل سلوكها. من خلال إجراء مسح لالمهبلية وصفها هنا، يمكن التعرف على المراحل الأربع للنزو جنسي: شبق، تلية الوداق، هجوع الودق، ومقدمات الوداق. وهذا يسمح لنا لتقييم السلوك عند المبيض هرمونات سوالفصل كما هرمون الاستروجين هي بطبيعة الحال في تركيزات منخفضة وعالية. على سبيل المثال، ومستويات هرمون الاستروجين منخفضة خلال شبق (20-40 جزء من الغرام / مل)، تلية الوداق (15-20 جزء من الغرام / مل)، وهجوع الودق (25-40 جزء من الغرام / مل) مراحل، ولكن ارتفاع خلال مقدمات الوداق (~ 75 خريج / مل) مرحلة من مراحل نزو جنسي 27،28. هذه المراحل لا تختلف فقط في الوسط الهرموني ولكن أيضا في المدة. على الرغم من أن المتغير، مقدمات الوداق تم عادة وحظ أن تستمر لمدة 12 إلى 14 ساعة. شبق لل25 إلى 27 ساعة. تلية الوداق لمدة 6 إلى 8 ساعات. وهجوع الودق لمن 55 إلى 57 ساعة. مدة كل مرحلة قد تكون أطول أو أقصر من يوم واحد (اعتمادا على الحيوان)، مما أدى إلى دورات لمدة 5 أيام والتي تشمل 2 أيام إما هجوع الودق أو شبق. وكما ذكر، مقدمات الوداق وتلية الوداق هي مراحل أقصر (12-14 و6-8 ساعة، على التوالي)، ويجوز تفويتها. في هذا البروتوكول، لذلك من المهم أن ترصد بدقة نزو جنسي عند استخدام الهرمونات ركوب الدراجات بشكل طبيعي الحيوان لدراسة الاختلافات بين المرحلة في القدرة على تذكر التدريب الانقراضمن اليوم السابق. ونزو جنسي في إناث الفئران، مثل الكثير من الدورة الشهرية الإنسان، هو أيضا حساسة للعديد من العوامل الخارجية، مثل العمر والإجهاد، والوقت من اليوم، وظروف السكن، ودرجة الحرارة وغيرها، وينبغي النظر عند التخطيط التجارب. قد تصبح حيوان اسيكليك (موسع شبق / هجوع الودق) أو عرض دورة غير منتظمة (أقصر من 4 أيام أو تزيد عن 5 أيام) قبل أو أثناء الدراسة. في هذه الحالة، سيتم استبعاد هذه الحيوانات من التحليلات التجريبية، ويجري صارمة لاختبار خلال مراحل معينة من نزو جنسي. المهم أن نلاحظ هي المراحل التي تمر بمرحلة انتقالية يتم خلالها خلط العينات مع المخاط، مما يجعل من الصعب قليلا إلى تحديد واضح لأنواع معينة من الخلايا التي تميز كل مرحلة. يمكن أن يكون هذا أيضا يرجع ذلك إلى وقت من اليوم يتم أخذ مسحة. إذا كان هناك كمية زائدة من إفرازات تشبه المخاط خلال جمع تشويه نتيجة لينظف اليومي، مما يسمح عدة أيام مناولة لتمر دون ينظفيمكن حل هذه المشكلة.
بالإضافة إلى طريقة تحديد المرحلة ودقي وصفها هنا، يمكن استخدام أدوات منهجية أخرى للحصول على تدابير تعميم تركيزات هرمون المبيض المصل. على سبيل المثال، وتركيز هرمون الاستروجين يمكن أن يكون كميا في عينات الدم باستخدام immunosorbant فحص انزيم مرتبط (ELISA). في هذا الإجراء، هرمون الاستروجين داخل المصل / البلازما عينات ربط إلى الضد المضادة للاستروجين محدد، الذي يرتبط انزيم. الركيزة الإنزيم تنتج رد فعل ينتج عنه إشارة واضحة مثل تغيير اللون التي يمكن قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. هذه الأداة بحساب الامتصاصية ويوفر الكمي لمستويات هرمون الاستروجين في العينة. هذه الطريقة يمكن أن تكون مفيدة في تقييم بشكل طبيعي تذبذب مستويات استراديول عبر نزو جنسي، والأهم من ذلك، في أوقات محددة أثناء التجربة. ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد كيفية إدارة خارجية من هرمون الاستروجين يمكن أن يغير القاعدةآل تركيزات الفسيولوجية. قياس تركيزات هرمون الاستروجين من الدم يمكن أن تمنع الصعوبات مع تحديد المرحلة خلال المراحل الانتقالية، أو عندما يصعب قراءة مسحات بسبب المخاط في العينات. لسوء الحظ، يمكن أن تصبح هذه الطريقة مكلفة جدا والعروض تأخر النتائج مقارنة جمع مسحة مهبلية.
إجراءات الحصول على عينات دم كافية، على سبيل المثال، عن طريق الوريد الذيل، والجيوب الأنفية المداري، وذيل القصاصة، والوريد الصافن 29، قد يسبب الضغط غير الضروري للحيوان. وهذا قد يؤثر على مستويات الهرمونات في الأوقات الحرجة في التجربة، مما يؤدي إلى قياسات غير دقيقة أو منحرفة. باستخدام جذع الدم لقياس مستويات استراديول هو محطة وبالتالي يوفر معلومات محدودة جدا حول التقلبات الهرمونية داخل مراحل. تقييم علم الخلايا خلية المهبلية يبدو لتقديم بديل أفضل. على الرغم من أن هذه الطريقة قد لا توفر سوى تقدير تقريبي لمحات هرمون المبيض عبر مراحل وداقية، ما في وسعهاتقليل التوتر وغير احقا أقل إرباكا لهذه التجربة السلوكية.
هناك أشكال مختلفة من المنشطات استروجين التي يتم تداولها بشكل طبيعي في البشر والحيوانات غير البشرية، مثل الإيستريول، استراديول، وإيسترون. في هذا البروتوكول، ويدار استراديول حاد عن طريق الحقن تحت الجلد. ويستخدم استراديول (مرادفا E2، 17beta استراديول أو بيتا استراديول) في هذا البروتوكول، لأنه هو الشكل الأكثر فعالية هرمون الاستروجين التي تحدث بشكل طبيعي في الإناث غير الحوامل 30. وعلى النقيض من حقن حادة من استراديول، قد استخدمت مختبرات غيرها من وسائل الإدارة الاستروجين المزمنة. على سبيل المثال، يزرع تحت الجلد من الكريات بطء الإفراج أو كبسولات silastic تسمح ثابت، والتسليم المستمر لهرمون الاستروجين أو مركبة حل 19. وعادة ما تستخدم هذا الإجراء بالتزامن مع ovariectomies، والتي تزيل الدولة الإنجابية الطبيعية الحيوان.
وmanipuجماعات سكانية مناقشتها هنا تركز على الدول الهرمونية الطبيعية لتسهيل التطبيق السريري للنتائج المعملية. الأفراد الذين يعانون من اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) يتم تخفيض قيمة عادة في قدرتهم على إخماد الخوف من الحوافز المتعلقة تجربتهم المؤلمة وأن نتذكر هذا الانقراض. هذا الشرط غالبا ما يستمر لفترة طويلة بعد لقد مر هذا الحدث. العلاج التعرض لفترات طويلة هو خيار العلاج شيوعا لاضطراب ما بعد الصدمة التي تعتمد على العمليات القائمة على الانقراض درس في نماذج القوارض مثل واحد هو موضح هنا. ومن المثير للاهتمام، هي تقريبا ضعف احتمال مثل الرجال لتطوير التوتر والاضطرابات ذات الصلة القلق النفسي 31 امرأة. هذا الاختلاف الجنس في انتشار قد تكون مرتبطة إلى الفروق بين الجنسين في عمليات الانقراض الخوف وراء الأهمية السريرية المحتملة لهذه النتائج المخبرية. وعلى الرغم من ارتفاع معدل انتشار اضطراب ما بعد الصدمة لدى النساء، وعدد قليل نسبيا يخشون وقد أجريت دراسات الانقراض في القوارض في الإناث. وتركز الدراسات الإناثجي على دور هرمونات الغدد التناسلية لا ينبغي إغفال عند دراسة الفروق بين الجنسين في السلوك. تميز الآثار السلوكية للتذبذب مستويات الهرمون بشكل طبيعي في جميع أنحاء نزو جنسي يوفر معلومات قيمة حول الاختلافات الأساسية في السلوك بين الذكور والإناث. يوفر هذا البروتوكول على النموذج الأساسي لتسهيل الدراسات المستقبلية من هرمونات المبيض وتأثيرها على، ولكن ليس على سبيل الحصر، العمليات المعرفية والسلوكية مثل الخوف الانقراض. يركز هذا البروتوكول على هرمون الغدد التناسلية معين، هرمون الاستروجين، ومع ذلك، يمكن أيضا أن يتم تقييم آثار هرمونات أخرى مثل هرمون البروجسترون والتيستوستيرون. باستخدام النموذج السلوكي المقدمة هنا جنبا إلى جنب مع التقنيات الدوائية، الخلوية، والجزيئية الأخرى (أي ضخ المخدرات الموضعية، المناعية، وصمة عار الغربية)، والبحث في المستقبل قد تحدد مواقع محددة / أهداف عمل هرمون الاستروجين في الدماغ الذي قد يزيد العلاج السلوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
واضعو هذا المخطوط ليس لديها مصالح مالية منافسة أو الصراعات الأخرى التي تهم الكشف عنها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
