Protocol
1. differenziazione Regia di Stem Cell-RPE derivati
NOTA: Tutte le fasi di incubazione sono eseguite a 37 ° C in 5% CO 2
- Mantenere le linee hES o anche (sfamare giorno) in mezzi di manutenzione (MM; Tabella 1). Una volta che le linee hanno raggiunto un livello sufficiente di controllo della qualità, li mantengono su uno strato di cellule feeder embrionali di topo (MEF) seminate ad una densità di 250.000 / pozzetto di una piastra ben sei. Culture senza Xeno possono anche essere generati seguendo il protocollo stabilito dalla Tucker et al. 40.
- Lasciare le colonie di cellule staminali per raggiungere confluenza.
- Passare ai media differenziazione Nicotinamide (DM / NIC, tabella 1); alimentare quotidiano.
- Dopo tre settimane di cultura, passare a mezzi di differenziazione con nicotinamide e sia Activin-A o IDE-1 (DM / NIC / AA o DM / NIC / IDE1; Tabella 1) per migliorare la differenziazione RPE. Dopo cinque settimane di cultura, tornare a DM / NIC. Poppate giornaliere non sono più necessarie, una volta gli indicatori di pH nei fermata supporto girando giallo il giorno dopo la poppata.
- Attendere isolotti di cellule pigmentate a comparire che sono abbastanza grandi per essere tagliato e rimosso (vedi figure 2D-F e 3A).
2. isolanti pigmentate Islets
- Rivestire le pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con una matrice che simula l'ambiente naturale delle cellule (senza xeno è preferibile).
NOTA: le lame affilate, cornea e pinze dalla punta sottile sono molto utili per la raccolta. L'intero foglio di cellule differenziate possono staccarsi mentre la raccolta. Evitare questo lavorando con attenzione e inizialmente raccolta colonie nel centro del piatto. - Riempire altrettanti pozzetti della piastra 24 pozzetti con i media differenziazione (DM; Tabella 1) come necessario. Questa decisione dipenderà dal numero di colonie pigmentateraccolti.
- In una cappa di coltura cellulare con un ambito dissezione, tagliate manualmente isolotti pigmentate. Tritare ogni isolotto sul fondo del piatto originale utilizzando un bisturi in circa 2-6 pezzi e afferrare le parti pigmentate con pinze taglienti.
- Trasferire 1-2 pezzi pigmentate in ogni 24 pozzetti.
- Non modificare i media per 3-5 giorni fino cellule aderiscono, quindi iniziare a cambiare i media tre volte a settimana. (Se non aderiscono dopo questo tempo, la probabilità è bene che non lo farà mai).
- Espandere le cellule per 3-4 settimane a supporto di differenziazione (DM; Tabella 1) - L'immagine di una cultura tipica è mostrato in figura 3B. Le cellule non possono ancora riempire tutto bene, ma aspettare più a lungo non sembra aiutare. Concime cellule tre volte alla settimana.
- Dopo circa 3 settimane, rimuovere manualmente gruppi di globuli bianchi in gruppi, se necessario, con una pinza taglienti. Non fare questo passo se non è necessario - è facile introdurre contaminanti. E 'ideale percercare di ottenere più pure popolazioni RPE dalle colonie pigmentate originali al punto 1.6.
RPE 3. Passaging Stem-Cell derivati
- Staccare cellule con 200 microlitri con una soluzione di dissociazione cellulare (preferibilmente non tripsina-un reagente che può essere inattivato mediante diluizione è preferibile) per 5-8 minuti a 37 ° C, e inattivare esso diluendo con DM. Utilizzare una pipetta 200 microlitri per lavare via tutte le cellule e risospendere loro (Se il pozzetto selezionato contiene solo poche cellule, prendere in considerazione la messa in comune le cellule da due 24 pozzetti).
- Centrifuga (800 xg per 5 minuti), scartare il surnatante e risospendere in 3 ml DM media.
- Cellule Re-piastra da uno (o due) 24 pozzetti in una matrice rivestite 6 pozzetti in 3 ml di DM per pozzetto (1: 5 di espansione).
- Espandere per 1-2 settimane, fino a quando le cellule sono ~ 90% confluenti; l'immagine di coltura pura completamente differenziata è mostrato in Figura 3C.
- Staccare le cellule con 1 ml di cellule dSoluzione issociation per circa 5-8 minuti a 37 ° C, inattivare dal diluizione con DM, utilizzare 1.000 microlitri pipetta per lavare via tutte le cellule, e risospendere.
- Spin down (800 xg per 5 minuti), scartare il surnatante e risospendere in 18 ml DM media.
- Cellule Re-piastra da 6 pozzetti uno ciascuno in sei matrice 6-pozzetti rivestiti in 3 ml di DM per pozzetto (1: 6 espansione) o uno rivestite 75 centimetri 2 beuta (1: 7,5 espansione).
- Ripetere i passaggi 3,4-3,8 necessaria fino a quando si ottengono abbastanza cellule.
NOTA: cercare di raccogliere il maggior numero possibile di colonie di espansione piuttosto che la pianificazione di amplificare le culture attraverso passaging poiché ogni passaggio induce RPE dedifferentiation.
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Representative Results
La procedura descritta in questo manoscritto, come illustrato nella figura 1, possono essere utilizzati per generare facilmente RPE da cellule staminali come precedentemente riportato 10,12. Dopo aver mantenuto le linee iPS per diverse settimane, colonie pigmentate cominciano ad apparire nelle colonie dopo 5-7 settimane (7 settimane vecchie culture sono mostrati in figura 2A-C). Queste colonie possono continuare a crescere per settimane come le culture sono mantenuti. Una volta raggiunto dimensioni sufficienti, come mostrato nella Figura 2D-F (8 settimane di età culture), possono essere asportati manualmente come illustrato nella Figura 3A. Escissione attenzione ad evitare la contaminazione con le cellule non-RPE agevolerà notevolmente la generazione di colture sufficientemente puri RPE (Figura 3B-C).
Figura 1: Schema raffigurante iPS-RPE derivazione Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: attivina A und piccole colonie pigmentate IDE-1 migliorare la resa di IPS-RPE. (A) cominciano ad apparire dopo sette settimane in coltura spontaneamente tra cellule non RPE in un singolo foglio che è aderente al fondo di una piastra da 6 pozzetti (alcuni sono contrassegnati con le frecce). (B e C), integrazione con i risultati IDE-1 o Activin A nella comparsa anche di colonie più pigmentati (alcuni sono contrassegnati con frecce in AC) a dimostrazione che la supplementazione con o Activin A o IDE-1 aumenta RPE differenziazione. (DF) Dopo 8 settimane gli effetti della supplementazione con IDE-1 o Activin A sono ancora più pronunciato. Sia il numero e le dimensioni delle isole pigmentate sono più grandi dopo la differenziazione diretta. Barra di scala = 5 mm
Figura 3: espansione e differenziazione terminaleiPS-RPE pigmentate. (A) immagine Rappresentante di una colonia di pigmentato iPS-RPE che è abbastanza grande da accise. Cellule non-RPE circondano la colonia nel fondo di una piastra da 6 pozzetti. Il contorno blu segna la regione che verrebbe asportato. (B) Immagine di post-confluenti cellule immature iPS-RPE della cultura dopo la prima fase di espansione. (C) due mesi di età differenziate cellule iPS-RPE. Si noti la presenza di bordi delle celle evidenti e livelli omogenei di pigmentazione che dimostrano differenziazione avanzata. Bar Scala = 100 micron
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Discussion
In questo manoscritto abbiamo delineare i passi per generare in modo efficiente grandi quantità di culture iPS-RPE puri. Abbiamo dimostrato in precedenza con questo protocollo di differenziazione diretto con Activin A che possiamo generare iPS-RPE che assomigliano fortemente hRPE base di trascrittomica, proteomica, metabolomica, e funzionalità, e che ritardare la degenerazione retinica quando impiantato in ratti RCS 12,31,32 . Il processo di generazione IPS-RPE richiede molto tempo, ma non laboriosa (Figura 1). Una volta che le culture IPS raggiungono la confluenza devono essere alimentati con mezzi differenziazione su base giornaliera. Ci completiamo i media sia con Activin A o una meno costosa piccola molecola IDE-1, e continuare ad alimentare per due settimane durante il monitoraggio delle culture per pigmentate colonie iPS-RPE che in genere compaiono dopo 5-7 settimane (Figura 2A-C). Una volta raggiunto dimensioni sufficienti (figure 2D-F e 3A), i colonies vengono rimossi manualmente e trasferite in piastre di espansione. Questo avviene approssimativamente dopo 8 settimane ed è il passo più laborioso l'intero protocollo.
L'aspetto più difficile è evitare la contaminazione con le cellule non-RPE nelle culture espansione raccogliendo accidentalmente cellule vicine indesiderate o intorno alle colonie pigmentate. A seconda del grado di contaminazione, isole di cellule non RPE possono essere rimossi manualmente durante l'espansione, anche se ogni volta le colture vengono trattate ulteriori rischi di introduzione di contaminanti batterici o fungini sono aumentati. Vale la pena notare che nella nostra esperienza IPS-RPE può effettivamente "outcompete" un piccolo numero di cellule contaminanti durante le fasi Passaging. Ma si consiglia vivamente di prendere molta cautela al momento del ritiro delle colonie per garantire che siano il più puro possibile per evitare di dover ricorrere a questa procedura. Con il secondo o terzo passaggio culture iPS-RPE sono sufficientemente puri e suffinumero cienti di cellule sono disponibili per la caratterizzazione e l'impianto.
La tecnica qui riportato non è certamente l'unico metodo per derivare cellule staminali derivate RPE. In realtà non è né il più facile né veloce. Il metodo più semplice e più ampiamente consiste nell'utilizzare differenziazione spontanea. (Tuttavia, la supplementazione con IDE-1 per due settimane è poco costoso e aumenta notevolmente la resa di IPS-RPE.) IPS-RPE hanno generato anche in corpi embrionali che differenziano in sfere di cellule RPE polarizzate che possono essere costretti ad aderire alla superficie piastre di coltura e si espandono come un monostrato. Cellule RPE generano con questo metodo sono stati anche molto energicamente caratterizzato e fortemente assomigliare hRPE 27. RPE in grado di differenziare in modo estremamente rapido (in soli 14 giorni) da cellule staminali integrando media con nicotinamide, IGF1, Noggin, Dkk1, e bFGF per convertirli in neurali progenitrici della retina destino, poi aggiungere il pro-RPE fattori nicotinamide unnd Activin A 37. RPE può essere generato ancora più rapidamente direttamente da fibroblasti in circa un mese trasduzione dei fibroblasti con un insieme minimo di fattori di trascrizione tra cui cMyc, MITF, OTX2, RAX, e CRX 44. Tuttavia, mentre questi risultati sono molto incoraggianti RPE generato questi ultimi due tecniche non sono ancora stati rigorosamente caratterizzato dal loro impianto in vivo. Pertanto, suggeriamo che il lettore consideri tutte le opzioni RPE derivazione con attenzione al momento di decidere quale impiegare nei loro studi.
I vantaggi di usare il protocollo descritto qui sono la sua semplicità e costantemente alte rese di RPE altissima qualità 31. La supplementazione con IDE-1, piuttosto che Activin A riduce notevolmente il costo complessivo e riduce il rischio connesso con l'utilizzo di proteine ricombinanti. Poiché non è ancora chiaro se la scelta di utilizzare diversi metodi di differenziazione avràun impatto sul prodotto finale, potrebbe essere vantaggioso utilizzare protocolli standardizzati, soprattutto se confronti diretti tra RPE generato nei vari laboratori saranno necessari (forse in particolare nel caso di modelli di malattia). Un protocollo semplice come questo che richiede poca esperienza e reagenti, e che genera ad alto rendimento di IPS-RPE, potrebbe essere l'ideale per queste situazioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
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