البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
الضامة هي خلايا غير متجانسة والبلاستيك التي تكون قادرة على الحصول على الظواهر وظيفية متميزة. وفي الجسم الحي، وهذه الخلايا تستجيب لمجموعة كبيرة ومتنوعة من signalssuch البيئية الدقيقة عن المنتجات الميكروبية، السيتوكينات، الخ. 1. في المختبر، والنمط الظاهري الموالية للالتهابات (M1) من البلاعم يمكن أن يسببها عديد السكاريد الشحمي (LPS) والنمط الظاهري المضادة للالتهابات (M2) من خلال بعض السيتوكينات مثل انترلوكين 4 (IL-4). وعلاوة على ذلك، يمكن الضامة التبديل من M1 M2 النمط الظاهري لتفعيلها، وعلى العكس، بناء على إشارات معينة 2.
اعتمادا على النمط الظاهري، سوف الضامة لها وظائف مختلفة. الضامة M1 هي الخلايا التي تنتج السيتوكينات الموالية للالتهابات، مثل عامل نخر الورم α (TNF-α)، لقتل الميكروبات أو الخلايا السرطانية 3. في المقابل، M2 الضامة تمنع هذه الاستجابة الالتهابية مثل في التئام الجروح والتليف عن طريق إنتاج مكافحة inflammatorذ العوامل مثل TGF-β 3،4.
تم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى الإنسان من المانحين صحية من خلال التدرج Ficoll الكثافة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا 5 باستخدام تقنية مقتبسة من Boyum 6. يمكن التفريق بين الضامة في الثقافة إلى M1 أو M2 النمط الظاهري بعد 6 أيام من الثقافة الابتدائية 7.
تحليل تعبير البروتين أو البروتين تغييرات بين اثنين من الأنواع الفرعية الضامة تحت مؤثرات تسيطر مختلفة، مثل المرضية المضيف أو السموم الميكروبية، وسوف تكون مفيدة فك وظائف المؤيدين والضامة المضادة للالتهابات.
البروتينات هي أدوات فريدة من نوعها لرصد مباشر من البروتينات التي هي حتى- على وجه التحديد أو التنظيم إلى أسفل في الضامة الإنسان المثقف في إطار مختلف المنبهات. وقد حل الأصباغ الفلورية بعض القيود من 2D الكهربائي للهلام، مثل انخفاض الحساسية وتحليل الصور 8 < / سوب>. الأصباغ التفاعل مع بقايا السيستين زادت حساسية الكشف مقارنة مع أولئك التفاعل مع بقايا يسين 9. في دراسة سابقة، أثبتنا فائدة DIGE الوسم تشبع لتحليل العينات النادرة 10 مقارنة الملطخة الفضة الكلاسيكية 2D الكهربائي 11. هذه التقنية مفيدة في تحليل سريع التعديلات البروتين بين اثنين من الأنواع الفرعية الضامة أو بين الضامة غير المعالجة والمعالجة من نفس النوع الفرعي.
مزايا هذه التقنية هي وجود البروتين الحصول على المعلومات من حجم البروتين والتعديلات بعد متعدية من خلال تحليل هلام 2D 12. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن هذه ليست تقنية إنتاجية عالية، مما يحد من عدد العينات التي يمكن تحليلها. تطوير فحوصات إنتاجية عالية تعتمد على الطيف الكتلي كما استعرضت مؤخرا 13 يمكن أن يحسن هذا.
_content "> هنا نقدم كيفية إجراء تحليل 2D DIGE من استخراج البروتين الضامة مثقف من خلال عمليات الكهربائي، isoelectrofocusing، وSDS-PAGE وكذلك معلومات عن فائدة برنامج 2D كاف.Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة لتحليل تأثير محفزات مختلفة من اثنين من الأنواع الفرعية الضامة، M1 (الموالية للالتهابات) و M2 (المضادة للالتهابات). وقد تم الحصول على الثقافات الأولية من M1 و M2 الضامة من التفريق بين حيدات كما نشرت سابقا 7.
<p class="jove_content" style=";text-align…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
