Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Les macrophages sont des cellules hétérogènes et plastiques qui sont capables d'acquérir des phénotypes fonctionnels distincts. In vivo, ces cellules répondent à une grande variété de micro signalssuch l'environnement comme les produits microbiens, des cytokines, etc. 1. In vitro, le phénotype pro-inflammatoire (M1) de macrophages peut être induite par le lipopolysaccharide (LPS) et le phénotype anti-inflammatoire (M2) par des cytokines telles que l'interleukine-4 (IL-4). En outre, les macrophages peuvent passer d'un M1 à M2 phénotype activé, et inversement, sur des signaux spécifiques 2.
En fonction du phénotype, les macrophages ont différentes fonctions. M1 macrophages sont des cellules qui produisent des cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), afin de tuer des micro-organismes ou des cellules tumorales 3. En revanche, les macrophages M2 empêcher ces réponse inflammatoire comme dans la cicatrisation des plaies et de la fibrose en produisant des anti-inflammatorfacteurs y tels que TGF-β 3,4.
Des cellules mononucléaires de sang périphérique humain provenant de donneurs sains ont été isolées par gradient de densité Ficoll centrifugation comme décrit précédemment en utilisant 5 une technique adaptée de Boyum 6. Macrophages en culture peuvent être différenciées en M1 ou M2 phénotype après 6 jours de culture primaire 7.
Analyse de l'expression des protéines ou des changements de protéines entre les deux sous-types de macrophages en vertu de divers stimuli contrôlés, tels que la pathogénicité d'accueil ou les toxines microbiennes, sera utile pour déchiffrer la fonctionnalité du pro- et anti-inflammatoires des macrophages.
Protéomique sont des outils uniques pour la surveillance directe de protéines qui sont spécifiquement en amont ou en réglementés dans les macrophages humains cultivés en vertu de divers stimuli. Les colorants fluorescents ont résolu certaines des limitations de l'électrophorèse sur gel 2D, tels que la faible sensibilité et l'analyse d'image 8 < / Sup>. Les colorants qui réagissent avec les résidus de cysteine ont augmenté la sensibilité de détection par rapport à ceux faisant réagir avec des résidus de lysine 9. Dans une étude précédente, nous avons démontré l'utilité de l'étiquetage DIGE de saturation pour l'analyse des échantillons rares 10 par rapport à la coloration à l'argent classique 2D électrophorèse 11. Cette technologie est utile pour analyser rapidement des modifications de protéines entre les deux sous-types de macrophages ou entre macrophages traités et non traités de la même sous-type.
Les avantages de cette technique sont protéomique avoir accès à l'information de la taille de la protéine et des modifications post-traductionnelles en analysant le gel 2D 12. Il doit être pris en compte que ce pas est une technique à haut débit, ce qui limite le nombre d'échantillons pouvant être analysés. Le développement de tests à haut débit basés sur la spectrométrie de masse tel que revu récemment 13 peut améliorer cette situation.
_content "> Ici, nous présentons comment effectuer l'analyse 2D DIGE de l'extraction de la protéine des macrophages en culture dans les processus de l'électrophorèse, isoélectrofocalisation, et SDS-PAGE ainsi que des informations sur l'utilité des logiciels 2D adéquate.Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici en détail une méthode pour analyser l'impact de divers stimuli des deux sous-types de macrophages, M1 (pro-inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire). Des cultures primaires de macrophages M1 et M2 ont été obtenus à partir de la différenciation de monocytes comme précédemment publié 7.
La procédure de l'électrophorèse sur gel 2D DIGE nécessite des matériaux et d'équipements spécialisés, tels que les cellules IEF pour plaques iso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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