Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l'étude des interactions ARN-protéine: L'IRE / IRP Exemple
Summary
Nous présentons ici un protocole d'analyser les interactions ARN / protéines. L'essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l'électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d'ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.
Abstract
Interactions ARN / protéines sont essentielles pour voies de régulation post-transcriptionnel. Parmi les protéines liant l'ARN cytosoliques les mieux caractérisés sont des protéines régulatrices du fer, et IRP1 IRP2. Ils se lient à repasser éléments sensibles (IRES) dans les régions non traduites (UTR) de plusieurs ARNm cibles, contrôlant ainsi la traduction ou la stabilité des ARNm. Interactions IRE / IRP ont été largement étudiés par l'EMSA. Ici, nous décrivons le protocole EMSA pour analyser l'activité IRE contraignant de IRP1 et IRP2, qui peut être généralisée à évaluer l'activité d'autres protéines liant l'ARN ainsi. Un lysat de protéine brute contenant une protéine de liaison à l'ARN, ou une préparation purifiée de cette protéine, est incubé avec un excès de 32 sonde d'ARN marquée au P, ce qui permet la formation du complexe. L'héparine est ajoutée à empêcher protéine non spécifique de liaison à la sonde. Ensuite, le mélange est analysé par électrophorèse non dénaturante sur un gel de Polyacrylamide. La sonde libremigre rapide, tandis que l'ARN / protéines expositions complexes de mobilité retardée; par conséquent, la procédure est aussi appelé «retard de gel" ou le dosage "de bandshift". Après achèvement de l'électrophorèse, le gel est séché et complexes ARN / protéine, ainsi que la sonde libre, sont détectés par autoradiographie. L'objectif global du protocole est de détecter et de quantifier IRE / IRP et d'autres interactions ARN / protéines. En outre, l'EMSA peut également être utilisé pour déterminer la spécificité, l'affinité de liaison, et la stoechiométrie de l'interaction ARN / protéine à l'étude.
Introduction
L'EMSA a été initialement développé pour étudier l'association de protéines de liaison à l'ADN avec des séquences d'ADN cible 1,2. Le principe est similaire pour les interactions ARN / protéine 3, qui est l'objet de cet article. En bref, l'ARN est chargé négativement et migrer vers l'anode pendant l'électrophorèse non dénaturant dans polyacrylamide (ou gels agarose). La migration dans le gel dépend de la taille de l'ARN, qui est proportionnelle à la charge. La liaison d'une protéine spécifique à l'ARN modifie sa mobilité, et les complexes migre plus lentement par rapport à l'ARN libre. Ceci est principalement dû à une augmentation de la masse moléculaire, mais aussi à des altérations de la charge et éventuellement conformation. Utilisant un ARN marqué comme sonde permet un contrôle facile de la «retard de gel" ou "bandshift". L'utilisation de 32 sondes d'ARN P marqué est très répandue et offre une sensibilité élevée. La migration des ARN / complexes de protéines et d'ARN libre sont détectéspar autoradiographie. Inconvénients sont la demi-vie courte de 32 P (14,29 jours), la détérioration progressive de la qualité de la sonde due à la radiolyse, l'exigence d'une licence de la radioactivité et de l'infrastructure pour les travaux de la radioactivité, et de biosécurité préoccupations potentielles. Par conséquent, les méthodes non isotopiques alternatives pour marquage de la sonde d'ARN ont été développés, par exemple avec de la biotine ou des fluorophores, qui permettent une détection par imagerie de fluorescence ou de chimioluminescence 4,5. Les limitations de ces procédés sont le coût plus élevé et souvent une sensibilité réduite par rapport à marquage isotopique et le potentiel de marqueurs non isotopiques pour interférer avec l'interaction ARN / protéine. Les non-dénaturantes des gels de Polyacrylamide sont appropriés pour la plupart des applications EMSA et sont couramment utilisés. À l'occasion, des gels d'agarose peuvent représenter une alternative pour l'analyse de grands complexes.
Le principal avantage de l'EMSA est qu'il combine la simplicité, la sensibilité et la robustesse 4 </ Sup>. Le test peut être réalisé en quelques heures et ne nécessite pas une instrumentation sophistiquée. Les interactions ARN / protéine peut être détectée par l'EMSA à des concentrations aussi faibles que 0,1 nm ou moins, et dans une large gamme de conditions de liaison (pH 4,0 à 9,5, monovalent concentration en sel de 1 à 300 mM, et la température de 0 à 60 ° C).
ARN / protéines formation du complexe peut également être étudié par le test de filtre contraignant. Ce est une procédure simple, rapide et peu coûteux basé sur la conservation de complexes ARN / protéines dans un filtre de nitrocellulose, tandis qu'une sonde d'ARN libre passe par six. Par rapport à l'EMSA, elle est limitée dans les cas où la sonde d'ARN contient de multiples sites de liaison, ou l'extrait brut contient plus d'une des protéines liant l'ARN qui se lient à la sonde sur le même site. Alors que de multiples interactions ARN / protéines seront échapper à la détection par le test de filtre contraignantes, elles peuvent être facilement visualisés par l'EMSA. Dans certains cas, la visualisation est veillen possible lorsque deux complexes ARN / protéines co-émigrer (par exemple, IRP1 humaine / IRE et IRP2 / complexes IRE), en ajoutant un anticorps dirigé contre l'une des protéines liant l'ARN à la réaction EMSA, ce qui donne encore un retard sur le gel ( "supershift") 7.
L'EMSA a été largement utilisé pour étudier IRP1 et IRP2, qui sont des régulateurs post-transcriptionnel du métabolisme du fer 8-10. Ils fonctionnent en se liant à IRE, structures en épingle à cheveux phylogénétiquement conservés dans les UTR de plusieurs ARNm 11. IRE ont été découverts dans les ARNm codant la ferritine 12 et récepteur de la transferrine 1 (TfR1) 13, les protéines de stockage du fer et de l'absorption, respectivement. Plus tard, IRE ont été trouvés dans érythroïde spécifique aminolévulinate synthase (ALAS2) 14, aconitase mitochondriale 15, 16 ferroportine, divalent transporteur de métaux 1 (DMT1) 17, l'hypoxie inducible factor 2 <em> α (HIF2α) 18, et d'autres ARNm 19-21. Le H- prototype et ARNm L-ferritine contiennent une IRE dans leur 5 'UTR, tandis que TfR1 ARNm contient plusieurs IRE à son extrémité 3' UTR. Interactions IRE / IRP spécifiquement inhiber la traduction de l'ARNm de la ferritine en bloquant stériquement son association des sous-unités 43S ribosomique; en outre, ils stabilisent TfR1 ARNm contre clivage endonucléolytique. IRP1 et la part de IRP2 vaste similarité de séquence et de présenter une activité élevée de IRE-contraignant dans les cellules de fer-affamés. Dans les cellules de fer-remplie, IRP1 assemble un cluster Fe-S cubane qu'il convertit en aconitase cytosolique au détriment de son activité IRE contraignant, tandis que IRP2 subit une dégradation par le protéasome. Ainsi, les interactions IRE / IRP dépendent du statut en fer cellulaire, mais sont également régies par d'autres signaux, tels que H 2 O 2, l'oxyde nitrique (NO) ou hypoxie. Ici, nous décrivons le protocole pour évaluer l'activité IRE liaison à partir d'extraits cellulaires bruts et de tissus par EMSA. Nous avons utilisé une sonde IRE marqué au 32P H-ferritine qui a été généré par transcription in vitro à partir d'une matrice d'ADN plasmidique (de I-12.CAT), où la séquence IRE a été initialement introduit dans l'orientation sens en aval du site de l'ARN polymerase T7 par clonage des oligonucleotides synthétiques annelés 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un protocole qui a été mis au point pour étudier les activités IRE contraignants de IRP1 et IRP2, et nous montrons des données représentatives. En utilisant différentes sondes, ce protocole peut également être ajustée pour l'étude d'autres protéines liant l'ARN. Une étape critique est la taille de la sonde. L'utilisation de sondes longues, ce qui est fréquent lorsque le site de liaison exacte est inconnue, peut entraîner des complexes ARN / protéine qui ne migrent pas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
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