IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)
Summary
Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.
Abstract
RNA / protein etkileşimleri transkripsiyon sonrası düzenleme yolları için kritik öneme sahiptir. En iyi karakterize edilmiş olan sitosolik, RNA bağlanan proteinler arasında demir düzenleyici proteinler, IRP1 ve IRP2 bulunmaktadır. Onlar böylece mRNA'ları çeviri veya stabilitesini kontrol, çeşitli hedef mRNA'larının çevrilmemiş bölgelerde (UTRs) içinde duyarlı elemanları (İres) demir bağlama. IRE / IRP etkileşimleri yaygın EMSA tarafından incelenmiştir. Burada, biz de diğer RNA bağlayıcı proteinlerin aktivitesini değerlendirmek için jeneralize olabilir IRP1 ve IRP2 ve IRE-bağlanma aktivitesi, analiz için EMSA protokol açıklar. Bir RNA bağlayıcı protein ya da bu proteinin bir saflaştırılmış preparatı ihtiva eden bir ham protein lisatı, kompleks oluşumunu mümkün kılan, 32P-işaretli RNA-uydusuyla fazlası ile inkübe edilir. Heparin bağlayıcı prob, spesifik olmayan protein önlemek için ilave edilir. Daha sonra karışım, bir poliakrilamit jeli üzerinde denatüre elektroforezi ile analiz edilir. ücretsiz probhızlı göç ederken RNA / protein kompleksi sergiler engelli hareketlilik; dolayısıyla, prosedür de "jel retardasyon" veya "bandshift" tahlil denir. Elektroforezin tamamlanmasından sonra, jel kurutulur ve RNA / protein kompleksleri, hem de serbest prob, otoradyografi ile takip edilmiştir. Protokolün genel amacı algılamak ve IRE / IRP ve diğer RNA / protein etkileşimleri ölçümüdür. Ayrıca, EMSA da araştırılmaktadır RNA / protein etkileşiminin özelliğini, bağlanma afinitesini ve stokiyometri belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
EMSA başlangıçta, hedef DNA dizileri 1,2 DNA-bağlayıcı proteinler arasındaki ilişkiyi incelemek için geliştirilmiştir. ilkesi, bu makalenin odak noktası RNA / protein etkileşimleri 3 için benzer. Kısaca, RNA, negatif yüklü ve poliakrilamid (ya da agaroz) jelleri içinde denatüre edici olmayan elektroforez sırasında anoda doğru hareket edecektir. Jel içinde göç yüküne orantılı olan RNA, büyüklüğüne bağlıdır. Belirli RNA bir proteinin bağlanması, serbest RNA ile karşılaştırıldığında karmaşık göç eder yavaş hareketliliğinin değiştirir ve. Bu molekül kütlesinde bir artışın, aynı zamanda yük ve muhtemelen konformasyonda değişikler kaynaklanmaktadır. Prob olarak etiketlenmiş RNA kullanımı "jel geriliği" veya "bandshift" kolay izlenmesine olanak sağlar. 32 P-etiketli RNA prob kullanımı çok yaygındır ve yüksek hassasiyeti sunar. RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA geçiş tespit edildiğindeOtoradyografi ile. Dezavantajları 32 P (14.29 gün), nedeniyle radyoliz prob kalitesinin kademeli bozulma kısa yarı ömrü vardır, bir radyoaktivite lisansı ve radyoaktivite çalışmaları için altyapı ve potansiyel biyogüvenlik kaygıları gereksinimi. Bu nedenle, bir RNA probu etiketlenmesine alternatif izotopik olmayan yöntemler, flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren görüntüleme 4,5 radarından olanak florofor ya da biyotin ile, örneğin, geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin Sınırlamalar yüksek maliyet ve izotopik etiketleme ile karşılaştırıldığında genellikle azalır duyarlılık ve RNA / protein etkileşimi ile müdahale olmayan izotop etiket potansiyeli vardır. Denatüre edici olmayan poliakrilamid jelleri en EMSA uygulama için uygun olan ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Vesileyle, agaroz jelleri büyük kompleksleri analizi için bir alternatif oluşturabilir.
EMSA büyük avantajı basitlik, duyarlılık ve sağlamlığı birleştiren 4 olduğunu </ Sup>. Deney birkaç saat içinde tamamlanabilir ve karmaşık bir cihaz gerektirmez. RNA / protein etkileşimleri 0.1 nM veya daha az gibi düşük konsantrasyonlarda EMSA ile tespit edilebilir ve geniş bir bağlanma koşulları aralığında (pH 4,0-9,5, tek değerli bir tuzu konsantrasyonu 1-300 mM ve sıcaklık 0-60 ° C).
RNA / protein kompleksi oluşumu, filtre bağlama deneyi ile incelenebilir. Serbest bir RNA probu 6 geçerken bu, bir nitroselüloz filtresi RNA / protein kompleksleri tutma dayalı bir basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. EMSA ile karşılaştırıldığında, bu RNA sistemi birden çok bağlayıcı siteler, veya ham ekstrakt aynı sitede prob bağlanan birden fazla RNA bağlayıcı proteinler içermesi durumunda sınırlıdır. Birden fazla RNA / protein etkileşimleri filtre bağlayıcı tahliliyle tespit kaçış olsa da, onlar kolayca EMSA tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bazı durumlarda, görselleştirme arifesidirn, mümkün olduğunca, jeli üzerinde daha fazla geriliği elde EMSA reaksiyonuna, RNA bağlanan proteinlerden biri karşı bir antikor eklenerek birlikte geçirmek (örneğin, insan IRP1 / İRE ve IRP2 / İRE kompleksleri) iki RNA / protein kompleksleri ( "süperkayma") 7.
EMSA yaygın demir metabolizması 8-10 transkripsiyon sonrası düzenleyiciler olan IRP1 ve IRP2, incelemek için kullanılır olmuştur. Onlar birçok mRNA 11 UTRs içinde İres, filogenetik korunmuş firkete yapıları bağlanarak çalışır. IRES ilk ferritin 12 ve transferrin reseptörü 1 (TfR1) 13, sırasıyla, demir depolanması ve alınması, proteinlerini kodlayan mRNA keşfedilmiştir. Daha sonra, İres eritroid özel aminolevulinate sentaz (ALAS2) 14, mitokondriyal akonitaz 15, ferroportin 16, iki değerlikli metal taşıyıcı 1 (DMT1) 17, hipoksi indüklenebilir faktör 2 bulundu <em> α (HIF2α) 18, ve diğer mRNA'lar 19-21. UTR'de 'TfR1 mRNA onun 3 birden İres içeriyor ise, UTR'de' prototip H ve L-ferritin mRNAlar onların 5 bir IRE'yi içerirler. IRE / IRP etkileşimleri özellikle sterik 43s ribozomal alt birim olan ilişkisini bloke ederek ferritin mRNA çeviri inhibe; Ayrıca, bu endonükleolitik klivaj karşı TfR1 mRNA'nın stabilize eder. IRP1 ve IRP2 payı geniş sekans benzerliği ve demir-aç hücrelerde yüksek İRE bağlayıcı aktivitesi sergiler. IRP2 proteozomal bozulmaya uğrar ise demirin bol olduğu hücrelerde, IRP1 onun İRE bağlama aktivitesi pahasına sitosolik akonitaz dönüştürür bir küban Fe-S, küme bir araya getirmektedir. Bu nedenle, İRE / IRP etkileşimi hücre demir durumuna bağlıdır, fakat aynı zamanda, H2O 2, nitrik oksit (NO) veya hipoksi gibi diğer sinyalleri tarafından düzenlenmektedir. Burada, biz E ham hücre ve doku ekstrelerinden IRE-bağlama aktivitesinin değerlendirilmesi için protokol tarifMSA. Bu İRE dizisi aslında tarafından alt baş T7 RNA polimerazı site sens yönlenmede katılmasının bir plasmid DNA şablonu (I-12.CAT), in vitro transkripsiyonu ile üretilen bir 32 P-etiketli lH-ferritin İRE sonda kullanılan tavlanmış, sentetik oligonükleotidlerin 22 klonlanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, IRP1 ve IRP2 ve IRE-bağlama faaliyetleri incelemek için geliştirilmiş bir protokol açıklar, ve biz temsilcisi verileri gösterir. Farklı problar kullanılarak, bu protokol, aynı zamanda, diğer RNA bağlama proteinlerinin çalışma için ayarlanabilir. Kritik bir safha, prob boyutu. Tam bağlanma yeri bilinmediğinde ortak uzun probların kullanımı, serbest RNA daha farklı geçiş olmayan RNA / protein kompleksleri ile sonuçlanabilir. Bu durumda, bu RNAz T1 (adım 6.6) ile muame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
References
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
