Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
réseaux d'interactions protéiques (NIP) offrent une faible carte de la résolution de la façon dont les protéines sont fonctionnellement organisés dans la cellule 1. Chaque connexion physique entre deux protéines, ou de l'interaction protéine-protéine (PPI), peuvent représenter une liaison qui est stable dans le temps, tels que ceux trouvés dans des complexes de protéines et qui contribuent à l'organisation structurelle de la cellule. Ces connexions peuvent également représenter les associations transitoires qui régulent l'activité, la stabilité, la localisation et les interactions des deux partenaires. Identifier les partenaires d'interaction physiques d'une protéine donnée fournit donc des informations riches sur la fonction et la régulation de cette protéine 2,3. Pour ces raisons, de gros efforts ont été mis à la cartographie des codes PIN dans des organismes modèles, y compris Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 12.8, Drosophila melanogaster </ Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 et 15 Homo Sapiens. Ces études ont fourni des informations importantes sur la façon dont les protéines sont organisés dans la cellule et de l'information ainsi clé sur les protéines avec des fonctions jusque-là inconnues.
Plusieurs stratégies ont été développées au cours des années à étudier NIP. Ces technologies peuvent être regroupés en trois catégories en fonction de la nature des informations qu'ils fournissent sur les IPP (revue dans 16-18). La première est basée sur deux hybrides de levure et 19 ses dérivés. Ces technologies fournissent des informations sur l'association directe entre des paires de protéines, ce qui permet la construction de réseaux binaires. La seconde famille est basée sur la purification par affinité de protéines d'appât et l'identification de leurs partenaires associés, tels que la purification par affinité suivie par spectrométrie de masse 20. Ces approches identifier des groupes de protéines qui sont directementou indirectement associée, généralement d'une manière stable, et sont extrêmement puissants pour identifier des complexes de protéines. La troisième approche est basée sur des essais de complémentation protéines fragment (APC) 11,21. Cette approche fournit un niveau de résolution intermédiaire entre les deux approches anciennes, car elle permet de détecter des liens directs entre les protéines et proximale. Chaque technique a ses propres forces et faiblesses, comme l'a récemment examiné 18.
Le code PIN eucaryote mieux décrit est de loin celui de la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, en partie parce que son protéome est relativement moins complexes que ceux des autres eucaryotes modèles et parce que des essais à haut débit pour détecter les IPP ont d'abord été testés et sont plus efficacement mis en œuvre dans cet organisme modèle 9-12. Un procédé particulièrement efficace pour le système de levure est la dihydrofolate réductase protéine-fragment complémentation dosage (DHFR-PCA), un essai qui a étéutilisé dans différents contextes d'étudier le code PIN de levure dans des conditions standard et perturbés 11,22-26. Cette méthode repose sur une analyse de survie qui permet la détection des IPP directs et quasi-directs pour une protéine appât donnée à ces deux niveaux d'expression endogènes et localisations subcellulaires indigènes des partenaires d'interaction 11,21 de manière quantitative 27. Le signal obtenu en utilisant ce dosage (ce est à dire de la taille des colonies sur les tableaux de colonies de haute densité) reflète ainsi la quantité de complexes protéiques formés entre l'appât et proie dans un environnement cellulaire presque équivalente à celle des cellules de type sauvage. Le dosage est basé sur la reconstitution d'une enzyme rapporteur impliqué dans le métabolisme des folates, le dihydrofolate reductase (DHFR), de sorte que deux fragments complémentaires de la DHFR qui sont fusionnés aux deux protéines d'intérêt sont mis en proximité lorsque les deux protéines interagissent, ce qui à son tour, conduit à la reconstitution de l'activité réversible de l'enzyme 1Et une croissance de la souche sur un milieu contenant du methotrexate (MTX; Figure 1). Ce composé inhibe l'enzyme DHFR endogène, mais pas celui muté utilisé dans l'essai 28. Deux collections de souches CPA, contenant une ~ 4300 souches MATa avec une ORF fusionné à la DHFR F [1,2] et un fragment contenant ~ 4800 MAT α souches avec un ORF fusionné à la DHFR [3] fragment, peuvent être achetés à mettre en œuvre DHFR-PCA à petite ou grande échelle dans tout laboratoire. Ici, nous décrivons un protocole général mais détaillée à l'écran pour les IPP entre une protéine appât et ~ 4800 protéines proies à l'aide de ce test.
Nous décrivons un protocole basé sur le dosage DHFR-PCA permettant l'identification systématique des interacteurs physiques pour toute protéine appât donnée à haut débit. Ce protocole peut être adapté par le dépistage de plus appâts, et ce, à ne importe quel niveau de la réplication souhaité. Nous démontrons la fiabilité de ce protocole par l'identification de partenaires d'interaction physiques pour une protéine appât impliqué dans le complexe pore nucléaire: Nup82. Notre analyse a permis de trouver cinq interacteurs signalés précédemment, et une Interactor non signalés précédemment (figures 3F et 3G), soulignant la capacité de la méthode pour étudier l'interactome des protéines de levure.
Le protocole décrit ici comprend plusieurs étapes critiques à laquelle l'expérimentateur devrait prêter attention. Nous recommandons à 1) Assurez-vous que la DHFR appât F [1,2] fusion est correcte (figure 1B); cela peut être réalisé par séquençage de la construction et mesuring expression de la protéine appropriée en utilisant un anti-DHFR F [1,2] ou anti-DHFR F [3] anticorps; 2) Avant de commencer l'écran, il est recommandé de vérifier si tout appât d'intérêt présente interactions promiscuité dans les écrans de l'APC. Cela peut être fait en effectuant les écrans de contrôle avec des appâts croisées avec la L-DHFR contrôle approprié ou manuellement par l'appât accouplement avec la L-DHFR contrôle approprié et en effectuant un essai de croissance dans un milieu MTX. 3) Les plaques doivent être versé le jour avant leur utilisation de sorte que l'humidité est optimale pour l'adhérence des cellules sur la surface de la gélose au cours du processus d'impression; 4) des plaques de source doivent pas être utilisés plus de quatre fois pour transférer suffisamment de cellules sur la plaque de destination. Augmenter le nombre de copies de la plaque de destination peut être effectuée par des étapes successives de l'expansion (par exemple de 4 copies -> 16 copies -> 64 copies). Alternativement, les cellules peuvent être ramassés à différentes positions sur les pelouses ou dans la colonie entre les différents cycles de réplication; 5) Si plusieurs pOSTES sont portées disparues après la sélection diploïde (s), assurez-vous que les plaques de source ne ont pas été utilisés trop souvent dans l'étape d'accouplement (étapes 4.5 à 4.7); 6) Se assurer que le milieu MTX contient tous les ingrédients essentiels à la bonne concentration. En effet, si aucune croissance du tout est observée sur le support MTX, il peut être soit parce qu'aucune interaction est détectable par l'APC pour les protéines d'intérêt ou parce que le milieu MTX ne était pas préparé correctement. Pour se assurer que le milieu permet la croissance de souches présentant DHFR complémentation de fragments, une interaction constitutive peut être ajouté à des positions vides, de la collecte et utilisée comme témoin positif tel que DHFR fragments fusionnés à fermeture éclair à leucine fragments 33 (figure 1C). Tests parallèles utilisant les fragments lieur-DHFR ou les fragments glissière-lieur-DHFR permettront de discriminer entre les conditions qui permettent toutes les cellules de croître (concentration de MTX à faible ou protéine appât qui ont tendance à rendre les interactions faux positifs, comme le described ci-dessous) et des conditions qui empêchent la croissance de toutes les souches (MTX ingrédient concentration trop élevée ou essentiel manquant dans le milieu); 7) Compte tenu de l'APC est réalisée par des cycles successifs de répétitions d'un milieu à un autre, la contamination croisée entre les souches entre les différentes plaques peut se produire si, par exemple, la broche-outil ne est pas stérilisé correctement entre les cycles de réplication et / ou la dernière eau bain (poste-à-dire l'état humide) dans la procédure de stérilisation est contaminé par des colonies de cycles de réplication précédentes. Plusieurs positions sur les tableaux sont vides et peuvent donc être utilisés comme postes de contrôle où doit être observé aucune croissance pour détecter les contaminations croisées.
L'analyse d'image peut être effectuée en utilisant plusieurs logiciels publiés (voir l'article 5 du protocole) ou tout script personnalisé. Dans cette étude, le script personnalisé exécute les étapes suivantes: 1) Le script soustrait les valeurs de pixels d'une assiette vide au pixel des valeurs de chaque plaque afin de correct les biais d'éclairage. 2) Le script convertit chaque image de fond corrigée en binaire en utilisant un seuil de 10. 3 de valeur de pixel) Pour chaque 1536 positions de chaque plaque, déterminée en superposant un rectangle sur les colonies de pointe, le script se exécute ImageJ "Analyser particules … fonction "dans une sélection circulaire. La sélection est réglée circulaire avec un rayon égal à l'intervalle entre deux positions moins 10 pixels. 4) Le script sélectionne la particule la plus proche du centre de la sélection et confirme comme une colonie si son emplacement ne est pas plus de la moitié de l'intervalle entre deux colonies du centre de la sélection. 5) Le script mesure des valeurs de pixel de la particule sélectionnée sur l'image de fond corrigée. 6) pour corriger en outre des distorsions restantes fond d'illumination, le script soustrait la valeur moyenne de tous les pixels de la sélection circulaire ne faisant pas partie d'une particule de valeurs de pixel de la colonie. La somme de ces valeurs de pixel corrigés, stockées dans la colonne "IntDenBackSub" du tableau supplémentaire 1, sont utilisés comme une mesure de la taille de la colonie.
Une étape critique dans la partie d'analyse est le choix du seuil de signification. Ici, nous avons choisi un seuil basé sur la distribution du négatif L-DHFR F [3] contrôles, mais en fonction de l'objectif de l'écran, ce seuil peut être trop strictes. En effet, la L-DHFR F [3] commandes sont surexprimé (fort promoteur de TEF) de telle sorte que les fragments complémentaires peuvent spontanément se complètent l'un l'autre et ceux-ci ne sont donc pas représentatifs de l'expression de la plupart des protéines. Ceci est mis en évidence par le fait que la répartition de la L-DHFR F [3] contrôles est supérieure à la moyenne de la croissance d'arrière-plan (figure 3D). Ainsi, certaines interactions ayant des notes inférieures à ce seuil strictes mais qui sont clairement en dehors de la distribution de la croissance de fond peut être considéré comme résultats putatifs qui peuvent représenter, par exemple, entre transitoire ou faibleactions. Ceux-ci peuvent être en outre étudiés et contre-validées que si, par exemple, les deux protéines ne sont pas exprimés à des niveaux qui peuvent permettre la complémentation spontanée des fragments DHFR comme les contrôles L-DHFR. Comme alternative, on pourrait fixer un seuil de signification sur la base de la proportion de chevauchement avec interacteurs physiques signalées dans des bases de données comme BioGRID 35 afin de maximiser la proportion de vrais positifs sur les faux positifs. Cependant, contrairement à l'utilisation de la distribution L-DHFR, cette solution ne est pas toujours possible si, par exemple, le nombre d'interacteurs physiques connues ne est pas suffisamment élevée. De plus, le choix du seuil de signification a une incidence sur la proportion de faux positifs et de faux négatifs dans l'ensemble de données final. En effet, comme tout autre essai de détection de PPI, les faux positifs peuvent résulter d'une interaction non spécifique d'une protéine avec la protéine DHFR-fusion si, par exemple, la protéine est très abondante comme mentionné plus haut. Cetteest illustré par le fait que certaines proies interagir systématiquement avec toutes les protéines d'appâts dans les écrans de l'APC et, par conséquent, doivent être retirés de l'analyse 11 (par exemple Tef2 et Ade17 et le tableau complémentaire 2). Pour contourner ce problème, un écran de contrôle de PCA des deux collections contre le contrôle L-DHFR approprié (F [1,2] ou F [3]) pour identifier les appâts et proies présentant spontanée DHFR fragmente complémentation peut être effectuée dans les conditions spécifiques de chaque écran. En outre, la réalisation d'une analyse de l'enrichissement Gene Ontology peut augmenter la confiance dans les données si la fonction d'un appât donnée est connue. D'autre part, DHFR-PCA peut donner lieu à des faux négatifs pour plusieurs raisons: 1) toutes les protéines peuvent être fusionnés aux fragments DHFR comme ceux-ci peuvent déstabiliser les protéines ou modifier leur localisation si, par exemple, la fusion à la DHFR C-terminale interfère avec un signal de localisation; 2) la reconstitution de la DHFR dans certains compartiments cellulaires may pas produire de folate si, par exemple, un précurseur essentiel à la synthèse de l'acide folique ne est pas disponible; 3) C-terminales besoin d'être dans un rayon de 8 nm pour DHFR complémentation de se produire 11. Ainsi, une interaction bien connue peut ne pas être détecté si leur C-terminales sont pas assez proche dans l'espace. Cela est illustré ici par le fait qu'une grande partie des interactions physiques Nup82 rapportés dans les bases de données, dont la plupart sont indirect, ne ont pas été détectée dans notre essai. De même, les interactions entre protéines membranaires dont les C-terminales sont en trans par rapport à la membrane ne conduiront pas à DHFR fragmente complémentation et ne sera pas détectée 11. Limitations 1) et 3) peut être contournée relativement simplement par fusion du fragment de DHFR à l'extrémité N-terminale de la protéine. Cela peut empêcher d'interférer avec un signal de localisation près de la C-terminales et peut permettre de détecter une interaction entre protéines membranaires dont N et C-terminale sont en cis par rapportà la membrane.
Plusieurs défis restent à relever dans l'étude des codes PIN (revue dans 2,3). Les cartes de broches produits jusqu'ici ont été largement décrit dans une seule condition expérimentale pour chaque espèce et d'offrir ainsi un instantané unique de la façon dont les réseaux de protéines pourraient être organisées. Il ya donc un besoin pour l'exploration d'autres conditions expérimentales de voir comment les codes PIN peuvent être réorganisées en réponse aux changements environnementaux, des stimuli spécifiques, à travers le développement ou des mutations suivantes. Ces défis seront surmontés par le développement de nouvelles technologies pour interroger IPP en temps réel, dans les cellules vivantes et en adaptant les techniques actuelles afin qu'ils puissent être utilisés par une grande communauté de laboratoires. Comme une technique quantitative qui permet de détecter les changements dans la quantité de DHFR complémentation complexes 27, DHFR-PCA peut être adapté pour surmonter ces défis et a été utilisé pour étudier comment les IPP sont affectés par un agent de l'ADN 22 endommager </sup>, 25 agents chimiques, la délétion de gènes 23,26 ou dans d'autres espèces de levures et leurs hybrides 33. L'étude de ces nouvelles dimensions deviendra de plus en plus important de révéler la dynamique du code PIN.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) Subventions 191 597, 299 432 et 324 265, du Conseil de recherches en génie du Canada subvention Discovery sciences naturelles et en une subvention Human Frontier Science Program à CRL. CRL est un nouveau chercheur des IRSC. Guillaume Diss est soutenu par une bourse PROTEO. Samuel Rochette est appuyé par le CRSNG et FRQNT bourses.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |