횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,
Summary
전기 주조, 젤 이용한 붓기 – 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.
Abstract
거대한 단일 층 소포 (GUVs)는 멤브레인 관련 현상 연구를위한 인기있는 생체 모방 시스템이다. 그러나, 일반적으로 트랜스 GUVs 기능적 단백질을 함유 GUVs 형성하기 위해 수정되어야 성장 프로토콜을 사용했다. 전기 주조 및 겔을 이용한 붓기 – – 전압 – 문이 칼륨 채널, KvAP를 포함 GUVs을 형성하기 위해이 문서에서는 두 탈수 수분 보충 방법을 설명합니다. 두 방법 모두에서, 단백질 – 함유 작은 단층 라멜라 소포 용액을 재수 버퍼 팽윤시킨다 막 스택을 형성하기 위해 부분적으로 탈수된다. AC 필드 막 재수 동안에인가 될 수 있도록 전기 주조 방법의 경우, 필름은 백금 전극 상에 증착된다. 대조적으로, 보조 팽윤 겔 방법은 막 재수 향상 아가 로스 겔 기판을 사용한다. 두 방법 (예를 들어, 5 mM)을 낮은 생리 (예를 들어, 100 mM)을 소금 농도 GUVs를 생성 할 수 있습니다. 얻어진 GUVs는 형광 현미경을 통해 특성화되고, 재구성 된 채널의 기능은 인사이드 아웃 (inside-out) 패치 – 클램프 구성을 사용하여 측정. 교번 전계 (전기 주조)의 존재 하에서 팽윤 무 결함 GUVs의 고 수율을 제공하는 동안, 보조 팽윤 겔 방법은보다 균일 한 분포 단백질을 생산 및 특별한 장치를 필요로하지 않는다.
Introduction
살아있는 시스템을 지배하는 물리적 원리를 연구하면, 상향식 접근법 실험가 시스템 조성물 쉽게 셀 기반 시스템 (1)에 조작되지 않은 다른 매개 변수를 제어 할 수있다. 10 – 그들은 현미경 연구 및 미세 조작 8에 적합하다로 7 – 멤브레인 기반 프로세스의 경우, 거대한 단일 층 소포 (GUVs, 직경 ~ ~ 100 μm의)는 매우 유용한 생체 모방 시스템 2를 입증했다. GUVs을 생산하는 여러 가지 프로토콜이 있지만, 대부분은 두 가지 범주로 구분 – 16 – 기반 에멀젼은 지질 필름 (13)을 재수에 따라 11, 12 및 기술에 접근한다. 에멀젼 계 방법에서, GUV 막의 내측과 외측 소엽 물 / 오일 계면에서 지질 단층으로부터 순차적으로 조립된다. 이 접근 방식과 수용성 단백질을 캡슐화에 이상적입니다GUVs, 그리고 비대칭 전단지 지질 조성 GUVs을 형성. 그러나, 에멀젼으로부터 형성된 GUVs 멤브레인의 기계적 특성을 변경 (17) 용매의 흔적을 유지할 수 있고, 방법은 트랜스 멤브레인 단백질 재구성에 특히 적합하지 않다.
필름 재수 방법 (탈수)에 의한 건조 막의 다중 층상 스택을 형성하기 위해 많은 지질 혼합물을 유발한다는 사실에 의존한다. 이 스택이어서 수성 완충액으로 접촉하여 배치되는 경우, 스택 막은 그들 사이 스택의 표면에서 떨어져 용매 흐름을 이동 개별 막은 GUVs 13,18 (도 전함 동물원을 형성하도록 분리 할 다른 지질 개체). 그러나, 최적의 버퍼와 지질 조성에 대해,이 고전 "자연 붓기"방법은 결함이없는 GUVs의 상대적으로 낮은 수율을 가지고있다. 무 결함 GUVs의 수율을 향상하기위한 한 방법은 널리 사용되는 "전기 주조 인교류 (AC) 필드가 막 중에 수분 공급 적용한 221 ;,. 메커니즘이 제대로 이해 남아있는 동안, "전기 주조"아름다운 GUV 수익률을 제공 할 수 있습니다 (> 유리한 상황에서 90 %) 낮은 소금 농도 버퍼 (<5 mM)을 14,19, 심지어 (~ 100 mM)을 생리 학적 버퍼에서 작업 할 수 사용 더 높은 주파수 (10 Hz에서 500 Hz로 대) AC 필드 백금 전극 (15). 무 결함 GUVs의 수율을 높일 수있는 대안이되는 지질 용액 (예, 유리, PTFE) 기판이 클래식 "자발적 팽창에 사용보다는 수동보다는 중합체 겔 기판 상에 증착되며,"겔 – 보조 팽윤 "입니다 ". 얻어진 지질 / 겔 막을 재수되면 GUVs 급속 심지어 생리 버퍼 16, 20에 대해 형성 할 수있다.
이러한 모든 방법들은 같은 멤브레인 관련된 현상을 연구하는데 사용될 수있는 전용 GUVs 지질을 생산할 수있다수용성 단백질과 세포막 사이의 상호 작용. 그러나 GUVs로 트랜스 막 단백질을 포함하는, 상당한 변형 단백질 재구성 절차 내내 작동 상태로 유지되도록 요구된다. 유기 용매 (예, 클로로포름, 시클로 헥산)에 지질 용액은 리피드 필름의 제조에 적합하지만 소수성 트랜스 멤브레인 도메인이 지질 이중층에 내장되거나 세제 미셀에 의해 포위되는 경우, 트랜스 멤브레인 단백질은 전형적으로 안정 ( 예를 들어, 단백질 정제 동안). 이와 같이, 재구성을위한 출발 물질은 통상적 세제를 제거함으로써 형성 네이티브 막, 세제 용액 중의 정제 된 단백질, 또는 작은 단일 라멜라 단백질 – 함유 소포 (proteo-의 SUVs) 및 / 또는 멀티 라멜라 베 시클 (proteo-MLVs) 인 지질의 존재. GUVs에 이러한 막 단백질을 포함하는 대부분의 방법은 세 가지 범주로 분류된다.
직접 InsertioN : 세제 현탁 트랜스 멤브레인 단백질이 예비 형성된 지질 단지 약간 용해 GUVs 세제와 혼합 한 후 biobeads 세제 (21)를 사용하여 제거된다. 개념적으로 단순하지만,이 방법은 너무 높은 세정제 농도는 단백질 농도가 전개 또는 응집의 원인이 너무 낮 동안 GUVs을 용해 할 수있는 바와 같이, 세제 농도의 정밀 제어를 필요로한다.
GUV / Proteo-SUV 퓨전 : proteo – 포드 SUV의 단백질은 미리 형성, 지질 전용 GUVs와 결합 및 융합 특별한 융해 펩티드 (22) 또는 세제 (21)와 용이하게된다. 일반적으로 융합의 정도가 낮은 단백질 밀도 GUVs을 선도 제한됩니다.
탈수 / 재수 : 단백질 함유 지질 필름 부분 proteo-SUV의 탈수 (또는 proteo-MLV) 솔루션과 GUVs에 의해 형성된다은 순수한 지질 필름으로 성장하고 있습니다. 명백한 도전 부분 dehydrati 동안 단백질을 보호하기위한 것이다25 – 23 단계 있지만 방법에서 성공적으로 GUVs 7,23 박테리오로돕신 예컨대 칼슘 ATP 아제, 인테그린 VDAC와 같은 트랜스 막 단백질을 재구성하는 데 사용되어왔다.
이 문서는 하이퍼 고온 성 고세균, 에로 피 룸속의 pernix에서 전압 개폐 칼륨 통로, KvAP을 함유 GUVs 있도록 탈수 / 재수 프로토콜을 설명한다. KvAP 진핵 전압 의존성 칼륨 채널 (26)에 높은 상 동성 및 공지 된 결정 구조를 갖는 27 전압 게이팅의 메커니즘을 공부 그것에게 좋은 모델을 만들기. proteo-SUV 차량의 생산 이전에 상세하게 설명이 튜토리얼 26,28,29의 일부가되었습니다. 중요한 KvAP의 proteo-한 SUV들이 장시간 (> 1 년)에 대해 -80 ° C에서 작은 (예를 들면, 10 μL) 분취 액에 저장 될 수 있으므로, 각 GUV 제제에서 제조 할 필요가 없다. 전기 주조또는 겔을 이용한 붓기는 KvAP의 proteo – 포드 SUV에서 GUVs을 성장하는 데 사용 (또는 proteo-MLVs) 할 수 있습니다.
전기 주조 프로토콜의 핵심 단계는도 1에 도시되어있다. 단백질을 포함 SUV 차량 용액의 방울 (도 2에 도시), 백금 와이어 상에 증착된다. SUV 현탁액 부분 탈수 SUV 차량의 융합을 통하여 지질 단백질 막의 형성을 유도. 재수 화 동안 AC 필드 GUVs을 박리하고 형성하는 지질 층을 돕기 위해 전극에인가된다. "저염"를 사용하는 경우 10 Hz의 필드가 잘 작동 (<5 mM)을 재수 버퍼 (28)와 GUVs는 몇 시간이 걸릴 성장합니다. 대조적으로, 생리 학적 완충액은 낮은 전압, 500 Hz의 AC 필드에서 잘 작동하지만, 필요 (~ 100 mM의 염을 포함하는) 장기간 (~ 12 시간) 동안 15 팽윤. 이 방법은 ITO (24)를 슬라이드하여 초기 프로토콜에 기초하지만, 맞춤 챔버를 계속 이용한다그림 2와 같이 두 개의 백금 와이어를 aining (간단한을위한 설계 세부 사항 및 제안 사항에 대한 설명을 참조하십시오, 챔버를 즉석에서).
도 3은 보조 팽윤 겔 방법을 나타내는 도면. 이 프로토콜은, 생리 소금 농도 버퍼와 함께 잘 작동 신속하고,보다 균일 한 단백질 분포 GUVs을 생산하고 있습니다. 그러나, 절연, 분명히 결함이없는 GUVs의 수율 (즉, GUV 막은 균일 한 광 길이 규모에 있고, 어떤 물체를 동봉하지 않음)에서 패치 클램프 및 마이크로 조작 실험에 충분한을 제공하지만, 낮은 . 이 방법은 지질 전용 GUVs 16을 제조하고 전기 주조 방법보다 덜 특수한 장비를 필요로 아가 로스 겔을 사용하는 프로토콜에 기초 하였다.
형광 현미경과 GUVs의 특성은 표준 패치 클램프 설정 최대를 사용하는 절차뿐만 아니라, 설명"인사이드 아웃 (inside-out)"에 KvAP 활동을 측정 멤브레인 패치를 절제.
성장 단백질 함유 GUVs 지질 전용 GUVs보다 더 어려울 수 있습니다. 특히, 최종 GUV 수율은 막 스택을 형성하는 방법을 정확히 SUV 용액이 증착되고, 탈수에 민감하게 의존 할 수있다. GUVs와 이전의 경험이없는 사람의 경우, 제 막 필름이 유기 용매로부터 지질을 증착함으로써 형성되는 종래의 프로토콜 15,16 다음 지질 GUVs 만 성장하는 것이 도움이 될 수있다. 기존의 프로토콜이 잘 작동되면, SUV의 증착 및 부분적인 탈수는 새로운 지질 조성물 프로토콜을 조정할 때 매우 유용 지질 전용 SUV 차량을 사용하여 마스터 할 수 있습니다. GUVs 지질 전용 SUV 차량에서 안정적 성장할 때 proteo-SUV의 발 – 함유 단백질을 생산하는 GUVs 단지 작은 단계 후이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 모방 모델 시스템은 단백질과 세포막의 특성과 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구입니다. BLMs 또는 지원 지질막과 같은 다른 재구성 시스템에 비해 GUV 시스템에게 상당한 막 조성, 긴장과 형상 제어뿐만 아니라 진정되는 오일 프리를 포함하여 현재 여러 기회를 기반으로. 그러나 GUVs로, 같은 KvAP으로 횡단 단백질을 포함하는 지질 전용 GUVs에 대한 기존의 프로토콜의 상당한 적응을 필요?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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