Rekonstituering af et transmembranprotein, Voltage ionkanal, KvAP, i Giant unilamelvesikler til mikroskopi og Patch clamp-forsøg
Summary
Genoprettelse af det transmembrane protein, KvAP, i gigantiske unilamelblærer (GUVs), er dokumenteret i to dehydrering-rehydrering metoder – electroformation og gel-assisteret hævelse. I begge fremgangsmåder er små unilamellare vesikler indeholdende proteinet fusioneret sammen for at danne GUVs, som derefter kan studeres ved fluorescensmikroskopi og patch-clamp elektrofysiologi.
Abstract
Giant unilamelblærer (GUVs) er et populært biomimetisk system til at studere membranassocieret fænomener. Men almindeligt anvendte protokoller til at vokse GUVs skal ændres for at danne GUVs indeholder funktionelle transmembrane proteiner. Denne artikel beskriver to dehydrering-rehydrering metoder – electroformation og gel-assisteret hævelse – at danne GUVs der indeholder spændingsstyret kaliumkanal, KvAP. Ved begge metoder en opløsning af proteinholdige små unilamellare vesikler er delvis dehydreret til dannelse af en stabel af membraner, som derefter lov til at kvælde i en rehydrering buffer. For electroformation fremgangsmåde filmen deponeret på platinelektroder, således at en AC felt kan påføres under film rehydrering. I modsætning hertil gel-assisteret hævelse metode anvender en agarosegel underlag til forøgelse film rehydrering. Begge metoder kan producere GUVs i lav (fx 5 mM) og fysiologiske (f.eks, 100 mM) saltkoncentrationer. De resulterende GUVs karakteriseres via fluorescensmikroskopi, og funktionen af rekonstituerede kanaler målt under anvendelse af inside-out patch-clamp-konfiguration. Mens hævelse i nærvær af et alternerende elektrisk felt (electroformation) giver et højt udbytte af fejlfri GUVs, gel-assisteret hævelse metode giver en mere homogen protein distribution og kræver ikke særligt udstyr.
Introduction
Når man undersøger de fysiske principper, der styrer levende systemer, bottom-up tilgange tillade en experimentalist at kontrollere systemets sammensætning og andre parametre, der ikke let manipulerede i cellebaserede systemer 1. For membran-baserede processer, har Giant unilamelvesikler (GUVs, diameter ~ 1-100 um) vist sig at være en meget nyttig biomimetisk System 2 – 7, da de er velegnede til mikroskopi studier og mikromanipulering 8-10. Selvom der er mange forskellige protokoller til at producere GUVs, de fleste falder i to kategorier – emulsion tilgange 11,12 og teknikker baseret på rehydrering en lipidfilm 13-16. I emulsionsbaserede fremgangsmåder er de indre og ydre foldere af GUV membraner samles sekventielt fra lipidmonolag på vand / olie-grænseflader. Denne fremgangsmåde er velegnet til indkapsling af opløselige proteiner medi GUVs, og til at danne GUVs med asymmetrisk brochure lipid sammensætning. GUVs dannet af emulsioner, kan dog beholde spor af opløsningsmiddel, som ændrer membranens mekaniske egenskaber 17, og den tilgang er ikke specielt velegnet til trans-membranprotein rekonstitution.
Film rehydrering metoder påberåbe sig, at tørring (dehydrering) forårsager mange lipidblandinger at danne en multi-lamellar stak af membraner. Hvis denne stak derefter anbringes i kontakt med en vandig buffer, vil membranerne i stakken bevæge sig fra hinanden som opløsningsmiddel strømme mellem dem og på overfladen af stablen kan individuelle membraner frigøre til dannelse GUVs 13,18 (samt en veritabel zoo andre lipidiske objekter). Men selv for optimale buffer- og lipidsammensætninger Dette klassiske "spontan hævelse" -metoden har et relativt lavt udbytte af fejlfri GUVs. En udbredt metode til at øge udbyttet af fejlfri GUVs er "electroformation221 ;, hvor en (AC) felt vekselstrøm påføres under film rehydrering. Mens mekanismen dårligt forbliver forstås "electroformation" kan give spektakulære GUV udbytter (> 90% under gunstige omstændigheder) for lavt saltindhold koncentrations- puffere (<5 mM) 14,19, og kan endda arbejde i fysiologiske puffere (~ 100 mm) under anvendelse en højere frekvens (500 Hz versus 10 Hz) AC felt og platinelektroder 15. En alternativ fremgangsmåde til at øge udbyttet af fejlfri GUVs er "gel-assisteret hævelse", hvor lipidopløsningen afsættes på en polymergel substrat snarere end den passive (f.eks glas, PTFE) substrater, der anvendes i klassisk "spontan hævelse ". Når den resulterende lipid / gel film rehydratiseres kan GUVs hurtigt danne selv for fysiologiske buffere 16,20.
Alle disse metoder kan producere lipid kun GUVs som kan anvendes til at studere membranassocierede fænomener såsomsamspillet mellem opløselige proteiner og membraner. For at inkorporere en trans-membranprotein i GUVs er væsentlige ændringer nødvendige for at sikre, at proteinet forbliver i en funktionel tilstand hele opløsningsprocessen. Mens opløsninger af lipider i organiske opløsningsmidler (fx chloroform, cyclohexan) er ideel til fremstilling af lipidfilm, trans-membranproteiner er typisk kun er stabilt, når deres hydrofobe transmembrane domæne er indlejret i et lipiddobbeltlag, eller omgivet af et detergent micelle ( fx under proteinoprensning). Således udgangsmaterialet til en opløsning er typisk native membraner, oprensede protein i en detergentopløsning, eller små unilamellare protein-holdige vesikler (Proteo-SUV'er) og / eller multi-lamellare vesikler (Proteo-MLV'er) dannet ved detergentfjernelse i tilstedeværelsen af lipider. De fleste metoder til at indarbejde disse membranproteiner i GUVs opdeles i tre kategorier.
Direkte insertion: Trans-membranprotein suspenderet i vaskemiddel blandes med pre-formet, lipid-only, mildt vaskemiddel opløste GUVs og vaskemiddel fjernes derefter ved hjælp Biobeads 21. Mens begrebsmæssigt enkel, denne metode kræver præcis styring af detergentkoncentrationen, som en for høj detergentkoncentration kan opløse GUVs mens en for lav koncentration kan forårsage, at proteinet foldes ud eller aggregat.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUV'er kombineres med præ-formet, lipid-kun GUVs og fusion lettes med særlige fusogene peptider 22 eller vaskemiddel 21. Typisk omfanget af fusion er begrænset fører til GUVs med lav protein tæthed.
Dehydrering / Rehydrering: Et protein, der indeholder lipid film dannes ved delvis dehydrering af en Proteo-SUV (eller Proteo-MLV) opløsning og GUVs dyrkes derefter som for en ren lipidfilm. Den indlysende udfordring er at beskytte proteinet under den delvise dehydratipå trin 23, men metoden er med succes blevet anvendt til at rekonstituere trans-membran proteiner såsom bacteriorhodopsin, Calcium-ATPase, Integrin og VDAC i GUVs 7,23 – 25.
Denne artikel beskriver dehydrering / rehydrering protokoller til at gøre GUVs indeholdende spændingsstyret kaliumkanal, KvAP fra hyper-termofile Archaea, Aeropyrum pernix. KvAP har en høj grad af homologi med eukaryot spændingsafhængige kaliumkanaler 26 og en kendt krystalstruktur 27 , hvilket gør det en god model til at studere den mekanisme af spænding gating. Produktionen af de Proteo-SUV'er er blevet beskrevet i detaljer tidligere, og er ikke en del af denne gennemgang 26,28,29. Vigtigere, do KvAP Proteo-SUV'er ikke at blive fremstillet for hver GUV forberedelse, da de kan opbevares i små (fx 10 pi) portioner ved -80 ° C i længere tid (> 1 år). Electroformationeller gel-assisteret hævelse kan derefter anvendes til at dyrke GUVs fra KvAP Proteo-SUV'er (eller Proteo-MLV'er).
De vigtigste trin i den electroformation protokol er illustreret i figur 1. Dråber af en opløsning af SUV'er indeholder proteinet aflejres på platin tråde (vist i figur 2). Delvis dehydrering af SUV suspension fører til dannelsen af en lipid-protein film ved fusion af SUV'er. Under rehydrering, er en AC felt påføres elektroderne for at bistå lipidlag at delaminere og danne GUVs. En 10 Hz felt fungerer godt, når du bruger "lav-salt" (<5 mm) rehydrering buffer 28 og GUVs tage flere timer at vokse. I modsætning hertil fysiologiske puffere (indeholdende ~ 100 mM salt) fungerer godt med en lavere spænding, 500 Hz AC område, men kræver en forlænget (~ 12 timer) hævelse periode 15. Denne metode er baseret på en tidligere protokol ved hjælp ITO slides 24, men bruger en brugerdefineret kammer containing to platin ledningerne som vist i figur 2 (se diskussionen for design detaljer og forslag til enklere, improviserede kamre).
Figur 3 illustrerer gel-assisteret hævelse metode. Protokollen fungerer godt med puffere med fysiologiske saltkoncentrationer, er hurtig, og producerer GUVs med en mere homogen protein distribution. Men (dvs. GUV membranen er ensartet på optiske længde-skalaer og ikke vedlægge nogen genstande) udbyttet af isolerede, tilsyneladende fejlfri GUVs er lavere, selv om det giver et tilstrækkeligt antal til patch-clamp og mikro-manipulation eksperimenter . Denne metode er baseret på en protokol anvendelse agarosegel for at fremstille lipid-only GUVs 16 og kræver mindre specialudstyr end electroformation metode.
Karakteriseringen af GUVs med fluorescens mikroskopi beskrives, samt procedurer ved hjælp af en standard patch-clamp set-up tilmåle KvAP aktivitet i "inside-out" udskåret membran patches.
Dyrkning proteinholdige GUVs kan være sværere end lipid kun GUVs. Navnlig kan den endelige GUV udbytte afhænger følsomt på præcis hvordan SUV opløsningen deponeret og dehydreres til dannelse af membranen stakken. For en person uden tidligere erfaring med GUVs, kan det være nyttigt først at vokse lipid kun GUVs efter en konventionel protokol 15,16 i hvilken membranen film dannes ved at deponere lipider fra et organisk opløsningsmiddel. Når den konventionelle protokol fungerer godt, kan SUV deposition og delvis dehydrering derefter mestrer hjælp lipid-kun SUV'er, som også er meget nyttigt, når justering af protokol for en ny lipid sammensætning. Når GUVs vokse pålideligt mod lipid-kun SUV'er, så er det kun et lille skridt til at producere proteinholdige GUVs fra Proteo-SUV'er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biomimetiske modelsystemer er et vigtigt redskab til at studere de egenskaber og interaktioner af proteiner og membraner. Sammenlignet med andre rekonstituerede systemer som BLMs eller støttet lipidmembraner, GUV baserede systemer til stede flere muligheder, herunder en betydelig kontrol over membranens sammensætning, spænding og geometri, samt blive virkelig oliefri. Men inkorporering transmembrane proteiner, såsom KvAP, i GUVs kræver betydelige tilpasninger af konventionelle protokoller for lipid kun GUVs. Den el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
