Tilberedning av et trans Protein, den Spenning ionekanal, KvAP, inn Giant unilamellær Blemmer for Mikros og Patch Clamp Studier

Summary

Rekonstituering av trans protein, KvAP, i gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) er vist for to dehydrering-rehydrering metoder – electroformation og gel-assistert hevelse. I begge fremgangsmåter, er små unilamellære vesikler som inneholder proteinet smeltet sammen for å danne GUVs som kan deretter bli undersøkt ved fluorescens mikroskopi og patch-clamp elektrofysiologi.

Abstract

Giant unilamellær Blemmer (GUVs) er en populær biomimetisk system for å studere membranassosiert fenomener. Imidlertid, som vanligvis brukes protokoller til å vokse GUVs må modifiseres for å danne GUVs som inneholder funksjonelle transmembranproteiner. Denne artikkelen beskriver to dehydrering-rehydrering metoder – electroformation og gel-assistert hevelse – å danne GUVs inneholder spennings gated kalium kanal, KvAP. I begge fremgangsmåter, er en oppløsning av protein-inneholdende små unilamellære vesikler delvis dehydratisert for å danne en stabel av membraner, som deretter tillatt å svelle i en rehydrering buffer. For electroformation fremgangsmåte blir filmen avsettes på platinaelektroder, slik at en vekselfelt kan brukes under film rehydrering. I motsetning til dette, benytter den gel-assistert svellende fremgangsmåte en agarosegel substrat for å forbedre film rehydrering. Begge metoder kan produsere GUVs i lave (f.eks, 5 mm) og fysiologiske (f.eks 100 mm) saltkonsentrasjoner. De resulterende GUVs er preget via fluorescens mikroskopi, og funksjonen av rekonstituert kanaler målt med innsiden ut patch-clamp konfigurasjon. Mens svelling i nærvær av et vekslende elektrisk felt (electroformation) gir et høyt utbytte av feilfrie GUVs, produserer den gel-assistert svellende fremgangsmåte en mer homogen proteinfordeling, og krever ikke noe spesielt utstyr.

Introduction

Når studere de fysiske prinsippene som styrer levende systemer, bottom-up tilnærminger tillate en experimentalist å kontrollere systemet sammensetning og andre parametere som ikke er lett manipulert i cellebaserte systemer ^1. For membranbaserte prosesser, har Giant unilamellær Blemmer (GUVs, diameter ~ 1-100 mikrometer) vist seg å være et svært nyttig biomimetisk system ^{2 – 7} som de er godt egnet for mikroskopi studier og micromanipulation ^8-10. Mens det er mange forskjellige protokoller for å produsere GUVs, de fleste faller inn i to kategorier – emulsjon basert nærmer ^11,12 og teknikker basert på rehydrere et lipid film ^13-16. I emulsjonsbaserte fremgangsmåter, er de indre og ytre brosjyrer av Guv membraner sammen i rekkefølge fra lipid monolag ved vann / oljegrenseflater. Denne tilnærmingen er ideell for innkapsling av vannløselige proteiner medi GUVs, og for dannelse av GUVs med asymmetrisk paknings lipid sammensetning. Imidlertid kan GUVs dannet fra emulsjonene beholder spor av løsningsmiddel som endrer membranens mekaniske egenskaper ^{for 17,} og tilnærmingen er ikke særlig godt egnet til trans-membranprotein rekonstituering.

Film rehydrering metoder er avhengige av det faktum at tørking (dehydrering) forårsaker mange lipid-blandinger til å danne et multi-lamellære stabel av membraner. Dersom denne stabel blir deretter plassert i kontakt med en vandig buffer, blir membranene i stabelen beveger seg fra hverandre som oppløsningsmiddel flyter mellom dem, og på overflaten av stabelen, kan individuelle membraner løsner å danne GUVs ^13,18 (samt en veritabel zoo andre lipidic objekter). Men selv for optimale buffer og lipid komposisjoner, har denne klassiske "spontan hevelse" metode en relativt lav avkastning av feilfrie GUVs. En mye brukt metode for å øke utbyttet av feilfrie GUVs er "electroformation221 ;, i hvilken en vekselstrøm (AC) felt påføres på film rehydrering. Mens mekanismen forblir dårlig forstått, "electroformation" kan gi fantastisk Guv utbytter (> 90% under gunstige forhold) for lav saltkonsentrasjon buffere (<5 mM) ^14,19, og kan også arbeide i fysiologiske buffere (~ 100 mM) under anvendelse av en høyere frekvens (500 Hz versus 10 Hz) AC-feltet og platina elektroder ^15. En alternativ tilnærming for å øke utbyttet av feilfrie GUVs er "gel-assistert svelling", der lipidoppløsningen er avsatt på en polymer gel substrat i stedet for den passive (for eksempel glass, PTFE) substrater anvendt i klassiske "spontan svelling ". Når den resulterende lipid / gel-filmen er rehydrert, kan GUVs raskt danner selv for fysiologiske buffere ^16,20.

Alle disse metoder kan produsere lipid-bare GUVs som kan brukes til å studere membran forbundet fenomener sominteraksjon mellom løselige proteiner og membraner. Imidlertid, for å innlemme et trans-membranprotein i GUVs, er betydelige modifikasjoner for å sikre at proteinet forblir i en funksjonell tilstand gjennom omdanningsprosedyren. Mens oppløsninger av lipider i organiske løsningsmidler (f.eks, kloroform, cykloheksan) er ideelle for fremstilling av lipid-film, trans-membranproteiner er typisk bare stabile når deres hydrofobe transmembrandomenet er innleiret i et lipid-dobbeltlag, eller omgitt av en detergent micelle ( for eksempel i løpet av protein rensing). Således er utgangsmaterialet for en rekonstituering typisk innfødte membraner, renset protein i en detergentoppløsning, eller små unilamellære proteinholdige vesikler (Proteo-SUVer) og / eller multi-lamellære vesikler (proteo-MLV) ble dannet ved fjerning av detergent i tilstedeværelse av lipider. De fleste metoder for å innlemme disse membran proteiner i GUVs faller inn i tre kategorier.

Direkte Insertion: Trans-membran protein suspendert i vaskemiddel er blandet med pre-formet, lipid-bare, mildt vaskemiddel solubiliserte GUVs, og vaskemiddel deretter fjernes ved hjelp biobeads ^21. Mens konseptuelt enkel, denne metoden krever nøyaktig kontroll av konsentrasjonen vaskemiddel, som for høy konsentrasjon vaskemiddel kan oppløse GUVs mens for lav konsentrasjon kan føre til proteinet for å brette eller aggregat.

GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUVer er kombinert med pre-formet, lipid-bare GUVs og fusjon er tilrettelagt med spesielle fusogene peptider ²² eller vaskemiddel ^21. Vanligvis omfanget av fusjon er begrenset fører til GUVs med lavt proteintetthet.

Dehydrering / Rehydrering: Et protein inneholdende lipid film blir dannet ved delvis dehydratisering av en proteo-SUV (eller proteo-MLV) løsning og GUVs dyrkes så som for en ren lipidfilm. Den åpenbare utfordringen er å beskytte protein under den delvise dehydratipå trinn ^23, men metoden har blitt brukt til å rekonstituere trans-membran proteiner som Bakteriorodopsin, kalsium-ATPase, Inte og VDAC inn GUVs ^{7,23 – 25.}

Denne artikkelen beskriver dehydrering / rehydrering protokoller for å gjøre GUVs inneholder spennings gated kalium kanal, KvAP, fra den hyper-varmekrevende Archaea, Aeropyrum pernix. KvAP har en høy grad av homologi til eukaryote spenningsavhengige kaliumkanaler ²⁶ og en kjent krystallstruktur ²⁷ , noe som gjør det en god modell for å studere mekanismen av spennings gating. Produksjonen av de Proteo-SUVer har blitt beskrevet i detalj tidligere, og er ikke en del av denne opplæringen ^26,28,29. Viktigst, KvAP Proteo-SUVer ikke å bli produsert for hver GUV preparat, som de kan lagres i små (for eksempel 10 mikroliter) alikvoter ved -80 ° C i lengre tidsperioder (> 1 år). Electroformationeller gel-assistert hevelse kan deretter brukes til å vokse GUVs fra KvAP Proteo-SUVer (eller proteo-MLV).

De viktigste fremgangsmåten for electroformation protokollen er vist i figur 1. Dråper av en oppløsning av SUV inneholdende proteinet avsettes på platinatråder (vist i figur 2). Delvis dehydrering av SUV-suspensjonen fører til dannelse av en lipid proteinfilm ved fusjon av SUVer. Under rehydratisering, er en AC-feltet påtrykkes elektrodene for å bistå lipid lagene å delaminere og danner GUVs. Et felt 10 Hz fungerer godt når du bruker "low-salt" (<5 mm) rehydrering buffer ²⁸ og GUVs ta flere timer å vokse. I motsetning til dette, fysiologiske buffere (inneholdende ~ 100 mM salt) fungere godt med en lavere spenning, 500 Hz AC-feltet, men krever en langvarig (~ 12 timer) svellende periode ^15. Denne metoden er basert på en tidligere protokollen med ITO glir ^24, men bruker en tilpasset kammer fortsinnelukker to platinatråder som vist i figur 2 (se diskusjonen for designdetaljer og forslag til enklere, improvisert kamre).

Figur 3 illustrerer den gel-assistert svelling metode. Protokollen fungerer godt med buffere med fysiologiske saltkonsentrasjoner, er hurtig, og produserer GUVs med en mer homogen proteinfordeling. Men (det vil si, er at GUV membran uniform på optiske lengde-skalaer og ikke vedlegge gjenstander) utbyttet av isolerte, tilsynelatende feilfrie GUVs er lavere, selv om det gir et tilstrekkelig antall for patch-clamp og mikro-manipulasjon eksperimenter . Metoden var basert på en protokoll ved hjelp av agarosegel for å produsere lipid-bare GUVs ¹⁶ og krever mindre spesialisert utstyr enn electroformation metoden.

Karakteriseringen av GUVs med fluorescensmikroskopi er beskrevet, samt fremgangsmåter ved bruk av en standard patch-clamp set-up tomåle KvAP aktivitet i "inside-out" utskåret membran patcher.

Voksende proteinholdig GUVs kan være vanskeligere enn lipid-bare GUVs. Spesielt kan den endelige GUV utbytte avhenger følsomt av nøyaktig hvordan SUV oppløsningen avsettes og dehydratiseres for å danne membranstabelen. For noen uten noen tidligere erfaring med GUVs, kan det være nyttig først å vokse lipid-bare GUVs etter en konvensjonell protokoll ^15,16 hvori membranfilmen dannes ved avsetning av lipider i et organisk oppløsningsmiddel. Når den konvensjonelle protokollen fungerer godt, kan SUV deponering og delvis dehydrering da bli mestret ved hjelp av lipid-bare SUVer, som også er veldig nyttig når du justerer protokollen for en ny fettsammensetning. Når GUVs vokse pålitelig fra lipid-bare SUVer, er det da bare et lite skritt for å produsere proteinholdig GUVs fra Proteo-SUVer.

Protocol

1. Løsning Forberedelse Forbered 5 ml "buffer SUV 'inneholdende 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) eller TRIS (pH 7,5), og 2 mM trehalose. Filtrere buffer med en 0,2 mikrometer sprøyte filter og dele inn i en ml porsjoner som kan lagres ved -20 ° C. MERK: Ytterligere detaljer for reagenser og instrumenter er gitt i listen over materialer. Forbered 40 ml GUV 'Vekst Buffer' som vil fylle GUV interiøret under film rehydrering. For en "lite salt 'vekst, kombiner 5 mM KCl,…

Representative Results

Veksten av GUVs raskt kan evalueres ved å undersøke vekstkammeret under mikroskopet. For electroformation de GUVs har en tendens til å vokse i bunter langs platinatråder, som vist i figur 4. Under gel-assistert hevelse, vises GUVs som sfæriske strukturer som hurtig vokser og smelte sammen (figur 5). Feilfrie GUVs er lettere identifiseres og evalueres etter overføring til en observasjon kammeret. Kalibreringsmålinger for å nøye vurdere GUV kvalitet, …

Discussion

Biomimetic modellsystemer er et viktig verktøy for å studere egenskapene og interaksjoner av proteiner og membraner. Sammenlignet med andre rekonstituert systemer som BLMs eller støttes lipidmembraner, GUV baserte systemer presentere flere muligheter, inkludert en betydelig styring av membran sammensetning, spenning og geometri, samt å være virkelig oljefri. Imidlertid, som omfatter transmembranproteiner, så som KvAP, inn GUVs krever betydelige tilpasninger av konvensjonelle protokoller for lipid-bare GUVs. Den el…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840101P
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375P
cholesterol (ovine wool, >98%)	Avanti Polar Lipids	700000P
TRed-DHPE	Invirtogen	T-1395MP	labeled lipid
BPTR-Ceramide	Invirtogen	D-7540	labeled lipid
Choloroform	VWR	22711.290	AnalaR Normapur
Acetone	VWR	20066.296	AnalaR Normapur
Ethanol	VWR	20821.330	AnalaR Normapur
Kimwipe	Kimtech	7552
Hamilton syringes	Hamilton Bonaduz AG		diverse
Amber vials and teflon cups	Sigma	SU860083 and SU860076
Parafilm	VWR	291-1214
microcentrifuge tube	eppendorf		diverse
Agarose	Euromex	LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
Sucrose	Sigma	84097-1kg
Glucose	Sigma	G8270-1kg
Trehalose	Sigma	T9531-25G
KCl	Sigma	P9333-1kg
Hepes	Sigma	H3375-100G
TRIS	Euromex	EU0011-A
Osmometer	Wescor	Vapro
pH meter	Schott instruments	Lab850
Sonicator	Elmasonic	S 180 H
Syringe filter 0.2µm	Sartorius steim	Minisart 16532
Function generator	TTi	TG315
Platinum wires	Goodfellow	LS413074	99.99+%, d=0.5mm
Polytetrafluoroethylene	Goodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'	VWR	1597418
sealing paste	Vitrex medical A/S, Denmark	REF 140014	Sigillum Wax
Cover slides 22×40 mm No1,5	VWR	631-0136
Cover slides 22×22 mm No1,5	VWR	631-0125
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G	airplasma, setting 'high'
petri dishes	Falcon BD	REF 353001	3.5 cmx1cm
patch clamp amplifier	Axon instruments	Multiclamp700B
DAQ Card	National Instruments	PCI-6221
Labview	National Instruments	version 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm	Harvard Apparatus	GC100-15
Electrode holder	Warner Instruments	Q45W-T10P
Micromanipulator	Sutter	MP-285
pipette puller	Sutter	P-2000
Camera	ProSilica	GC1380
Zeiss microscope	Zeiss	Axiovert 135
Objective	Zeiss		40x long working distance, Phase contrast
Objective	Zeiss		100x Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488)	Horiba	XF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed)	Horiba	XF101-2
beta-casein	Sigma	C6905-1G
confocal microscope	Nikon Eclipse TE 2000-E		D-Eclipse C1 confocal head
Objective	Nikon		Plan Fluor 100× NA1.3
matlab	Mathworks		for image processing and analysis of the current traces