La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Abstract

Determinar el modo de acción de los productos químicos bioactivos es de interés para una amplia gama de académico, farmacéutico, y los científicos industriales. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura en ciernes, es un modelo eucariota para la que una colección completa de ~ 6000 mutantes de deleción de gen y gen esencial hypomorphic mutantes están disponibles comercialmente. Estas colecciones de mutantes se pueden utilizar para detectar sistemáticamente la interacción química de genes, es decir, genes necesarios para tolerar una sustancia química. Esta información, a su vez, informa sobre el modo probable de acción del compuesto. Aquí se describe un protocolo para la identificación rápida de las interacciones químicas genética de la levadura en ciernes. Demostramos el método que utiliza el agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tiene un mecanismo bien definido de acción. Nuestros resultados muestran que la TRAMP nuclear RNA se necesitan enzimas de exosoma y de reparación del ADN para la proliferación en presencia de 5-FU, que es coherente con m anterioricroarray enfoques basados ​​de códigos de barras químicos genéticos y de los conocimientos que el 5-FU afecta negativamente tanto el metabolismo de ARN y ADN. También se describen los protocolos de validación solicitada de estas pantallas de alto rendimiento.

Introduction

Las herramientas genéticas y los recursos disponibles en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae han permitido a gran escala estudios de genómica funcional que proporcionan colectivamente una nueva visión de cómo los genes funcionan como redes para cumplir con los requisitos de los sistemas biológicos. La piedra angular de estas herramientas fue la creación en colaboración de un conjunto completo de no esenciales supresiones de genes de todos los marcos de lectura abierta en la levadura ^1,2. Una observación sorprendente fue que sólo ~ 20% de los genes de levadura se requiere para la viabilidad cuando se cultiva como haploides en condiciones estándar de laboratorio. Esto pone de relieve la capacidad de una célula para amortiguar contra perturbaciones genómico a través de la utilización de las vías biológicas alternativas. Mutantes genéticos que sean viables individualmente, pero letal en combinación, señalan caminos biológicos paralelos conectados o convergentes y forman redes de interacción genéticos que describen la función biológica. Con el desarrollo de te condicionalalelos mperatura sensibles y hypomorphic de genes esenciales de la tecnología no se ha limitado al estudio de los genes no esenciales ^3,4. Este concepto ha sido aplicado en una escala genómica producir un imparcial mapa interacción genética que ilustra cómo los genes implicados en los procesos celulares similares se agrupan ^5.

Perturbaciones químicas de redes genéticas imitan supresiones de genes (Figura 1) ^6. Consulta de compuestos inhibidores del crecimiento contra un array de alta densidad de cepas de deleción para la hipersensibilidad identifica un perfil de interacción química y genética, es decir, una lista de genes que se requiere para tolerar el estrés químico. Al igual que las interacciones genéticas, pantallas de gran escala de las bibliotecas químicas han demostrado que los compuestos con un modo similar de racimo acción juntos ^7. Por lo tanto, mediante el establecimiento del perfil de interacción química y genética de un compuesto el modo de acción se puede deducir mediante la comparación con LARinteracción genética genética y química sintética ge-escala datasets ^8,9.

Pantallas de química y genética a gran escala, donde son interrogados decenas de compuestos, se han realizado ensayos de competición por código de barras. En este enfoque, la colección agrupada de las cepas de deleción se cultiva en masa durante varias generaciones en un pequeño volumen de medio que contiene una sustancia química. Dado que cada mutante de deleción alberga un código de barras genético único, la viabilidad / crecimiento de mutantes individuales dentro de la piscina de supresión cepas se realiza un seguimiento de microarrays o de alto rendimiento de secuenciación ^10.

Inferir la aptitud mediante el control de tamaño de las colonias de mutantes físicamente dispuestos cultivadas en agar sólido que contiene un compuesto bioactivo es también un método eficaz para identificar las interacciones química y genética ^11,12. Este enfoque proporciona una alternativa rentable a la selección basada en la competencia y es muy adecuado para el ensayo de las pequeñas bibliotecas de productos químicos.Esbozado aquí es una metodología sencilla para producir una lista de interacciones químicas genética en S. cerevisiae que no se basa en la manipulación molecular o la infraestructura de biología. Se requiere sólo una colección deleción de levadura, un aparato de colocación de clavos robótico o manual, y el software de análisis de imagen disponible libremente.

Protocol

NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 2. 1. Determinación de la dosis inhibidora del crecimiento Preparación de la levadura cultivo durante la noche NOTA: Los medios de crecimiento de la levadura-extracto-peptona-dextrosa (YEPD) utilizado en este protocolo es una receta estándar 13. Streak a las células en una placa de agar YEPD BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) y se i…

Representative Results

Como una validación de este enfoque se realizó una pantalla genética química representante interacción del agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU) siguiendo el protocolo descrito anteriormente. 5-FU es conocido para interrumpir la timidilato sintasa, así como ADN y ARN metabolismo 18. Las interacciones genéticas químicas de 5-FU son bien estudiado y se han investigado mediante técnicas de microarrays de código de barras de la levadura utilizando ambas colecciones supresión heterocigotos y …

Discussion

Esbozado aquí es un enfoque para la generación de perfiles de interacción química y genética. El método es simple: mediante la comparación de tamaños de colonia de cada cepa en colecciones integrales de supresión de genes en presencia y ausencia de un producto químico, todos los genes necesarios para tolerar un insulto química se identifican. Análisis de enriquecimiento de anotación de la lista resultante de cepas sensibles a continuación, se puede utilizar para proporcionar información sobre un modo de p…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Yeast Extract	BioBasic	G0961	For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder	BD Biosciences	211820	For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose	Anachemia	31096-380	For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A	Bio Basic	FB0010	For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418	A.G. Scientific Inc.	G-1033	Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize.
12 well plate	Greiner Bio One	655180
5ml culture tubes	Evergreen Scientific	222-2376-080
10cm Petri Dish	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments	ROT-001	high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish	Singer Instruments	PLU-001	Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad	Singer Instruments	RP-MP-384	Box of 1000 pads
1536 Short-Pin RePad	Singer Instruments	RP-MP-1536	Box of 1000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems	S&P robotics	http://www.sprobotics.com	Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools	V&P Scientific	http://www.vp-scientific.com	Handheld replication tools and accessories.