Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Determinare la modalità di azione delle sostanze chimiche bioattive è di interesse per una vasta gamma di accademici, farmaceutico, e gli scienziati industriali. Saccharomyces cerevisiae, o lievito in erba, è un modello eucariote che una collezione completa di ~ 6.000 mutanti di delezione genica e hypomorphic gene essenziale mutanti sono disponibili in commercio. Queste collezioni di mutanti possono essere utilizzati per rilevare sistematicamente interazioni chimico-gene, cioè geni necessari a tollerare una sostanza chimica. Queste informazioni, a sua volta, riporta sulla modalità probabile di azione del composto. Qui si descrive un protocollo per la rapida identificazione di interazioni chimiche-genetico in erba lievito. Noi dimostriamo il metodo utilizzando l'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU), che ha un meccanismo ben definito di azione. I nostri risultati mostrano che il vagabondo nucleare rna exosome e riparazione del DNA enzimi sono necessari per la proliferazione in presenza di 5-FU, che è coerente con le precedenti microarray approcci basati su codice a barre chimico genetiche e le conoscenze che il 5-FU influisce negativamente sia il metabolismo RNA e DNA. Sono descritti anche i protocolli di validazione richieste di questi schermi ad alto rendimento.
Introduction
Gli strumenti e le risorse disponibili nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae genetici hanno permesso grandi studi di genomica funzionale che forniscono insieme nuovi indizi su come i geni funzionano come reti per soddisfare i requisiti dei sistemi biologici. La pietra angolare di questi strumenti è stata la creazione collaborativa di un set completo di delezioni geniche non essenziali di tutte le fasi di lettura aperte nel lievito 1,2. Un'osservazione sorprendente è che solo il ~ 20% dei geni di lievito sono necessari per la vitalità quando cresciuto come aploidi in condizioni standard di laboratorio. Ciò evidenzia la capacità di una cellula per tamponare contro perturbazioni genomiche attraverso l'utilizzo di percorsi biologici alternativi. Mutanti genetici che sono vitali singolarmente, ma letali in combinazione, segnalano percorsi biologici paralleli collegati o convergenti e formano reti di interazione genetica che descrivono la funzione biologica. Con lo sviluppo di te condizionalealleli mperature-sensibili e hypomorphic di geni essenziali della tecnologia non è stato limitato allo studio di geni non essenziali 3,4. Questo concetto è stato applicato su scala genomica produce un imparziale mappa interazione genetica che illustra come i geni coinvolti in processi cellulari simili raggruppano 5.
Perturbazioni chimiche di reti genetiche delezioni geniche mimici (Figura 1) 6. Interrogazione composti inibitori della crescita contro una matrice ad alta densità di ceppi di eliminazione per ipersensibilità identifica un profilo di interazione chimico-genetico, cioè una lista di geni che è richiesto di tollerare lo stress chimico. Come interazioni genetiche, schermi di grandi dimensioni di librerie chimiche hanno dimostrato che i composti con una modalità d'azione simile grappolo insieme 7. Pertanto, stabilendo il profilo interazione chimica-genetica di un composto della modalità di azione può dedurre confrontandola con larinterazione genetica e chimica sintetica ge scala genetica Dataset 8,9.
Schermi chimico-genetico su larga scala, in cui vengono interrogati decine di composti, sono stati eseguiti da saggi concorrenza barcode. In questo approccio, la raccolta aggregata dei ceppi di delezione è coltivato in massa per diverse generazioni in un piccolo volume di supporti contenenti una sostanza chimica. Dal momento che ogni mutante eliminazione nasconde un codice a barre genetico unico, la redditività / crescita dei singoli mutanti nel pool di ceppi cancellazione è monitorata da microarray o high-throughput sequencing 10.
La presunzione di idoneità monitorando dimensioni colonia di mutanti fisicamente Arrayed coltivate su agar solido contenente un composto bioattivo è anche un metodo efficace per identificare interazioni chimiche-genetica 11,12. Questo approccio offre un'alternativa conveniente per lo screening basato sulla concorrenza ed è adatto per saggiare le piccole librerie di sostanze chimiche.Delineato qui è una semplice metodologia per la produzione di un elenco di interazioni chimico-genetico in S. cerevisiae che non si basa su manipolazioni biologia molecolare o infrastrutture. Si richiede solo una collezione di eliminazione di lievito, un apparato pinning robotizzato o manuale, e liberamente disponibili software di analisi dell'immagine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Delineato qui è un approccio per la generazione di profili di interazione chimico-genetico. Il metodo è semplice: confrontando le dimensioni delle colonie di ciascun ceppo in complete collezioni delezione genica in presenza e in assenza di una sostanza chimica, tutti i geni necessari per tollerare un insulto chimica sono identificati. Analisi annotazione arricchimento della lista risultante dei ceppi sensibili può quindi essere utilizzato per fornire una visione in una modalità di azione chimica. Mentre questo proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca in laboratorio CJN è sostenuto da sovvenzioni di funzionamento dal NSERC, la Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), e la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
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