Bir<em> İn Vitro</em> Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles
Summary
Galyum (III) 'ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.
Abstract
Kemoterapi genellikle birçok yan etkileri ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir. Corroles kenetlenmiş metal fonksiyonel gruplar kimlikleri bağlı olarak belirli bir hücre hatlarında farklı sitostatik ve sitotoksik özellikleri sergileyen tetrapyrrolic makrosikllerin sınıfıdır. Belirli hücre hatları yönelik fonksiyonlandırılmış corroles benzersiz davranışı hedeflenen kemoterapi olasılığını tanıttı.
Bir çok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Burada bilinen ve potansiyel inhibitörlerin varlığında RNA transkripsiyonu için adım adım protokol mevcut. jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi yoluyla transkripsiyon reaksiyonu RNA ürünlerin değerlendirilmesi, etki mekanizması ile ilgili daha fazla tahlil değişiklikler ile, potansiyel anti-kanser ilaç adaylarının önleyici özellikler hakkında bilgiler verir ve.
Küçükcorrole sitotoksisite etkilerinin moleküler mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Galyum (III) '5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc): Bu deneyde, iki corrole bileşikleri göz önünde bulundurun. Bir RNA transkripsiyon tahlil corroles ve önleyici özelliklerini incelemek için kullanılmıştır. Beş transkripsiyon reaksiyonları hazırlanmıştır: sırasıyla 0.01, bir [şablon DNA baz] oranı ve tedavi edilmemiş kontrol: Bir [kompleks] at Aktinomisin D, Triptolide, Ga (tpfc), tpfc ile tedavi DNA.
transkripsiyon reaksiyonları, agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 4 saat sonra analiz edilmiştir. Ga (tpfc), Aktinomisin D, ve Triptolide tarafından açık engelleme vardır.
Bu RNA transkripsiyon deneyi veya tamamlanıncaya ile DNA ya da polimeraz inkübe edilerek anti-kanser kompleksi, DNA, ya da polimeraz enziminin konsantrasyonları değiştirilerek daha mekanistik ayrıntı sağlamak için değiştirilebilirönce RNA transkripsiyonu için xes; Bu modifikasyonlar, DNA ya da enzim içeren bir inhibisyon mekanizması arasında ayrım olacaktır. RNA kopyalama komplekslerinin indirgeme olmadığını test ya da RNA'yı hidrolize etmek için kullanılabilir sonra kompleks ekleme. Bu deney aynı zamanda ek anti-kanser adaylar incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Kemoterapi genellikle istenmeyen yan etkiler ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir, ancak kanser biyolojisi daha iyi anlaşılması ile, yüksek kanser hedefleme etkinlik ve daha az yan etki ile antikanser ajanlar için giderek artan bir talep var. 1 İnsan kanser hücreleri sıklıkla haline Hayatta kalmak için tek aktif olduğu veya aşın onkogen bağlıdır. Bu nedenle 2, birçok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Bu dönüştürme genlerin ekspresyonunu bloke tedaviler kanser hücrelerini giderilmesinde etkilidir ve hücre ölümüne yol açar., Normal hücrelere tekabül eden 3'ten Dönüştürülmüş hücreler, RNA transkripsiyonu ile bozulmalara karşı daha duyarlıdır. Selektif olarak inhibe eden beklenen transkripsiyonunu inhibe 4 Kansere karşı preparatlar kanser hücresi hayatta kalması için gerekli olan onkogenlerin tanım. 5 Sonuç olarak, RNA transkripsiyonunhibition potansiyel antikanser ilaç adayları belirlemek ve etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanışlı bir yoldur. Bu protokol Ga (tpfc) kemoterapi ilaçları Aktinomisin D ve Triptolide aynı sipariş RNA transkripsiyonunu inhibe ettiğini göstermektedir; Benzer karşılaştırmalar için diğer anti-kanser ilaç adaylarının bu protokol kullanılarak yapılabilir. Aktinomisin D yaygın gestasyonel trofoblastik kanseri, testis kanseri, Wilm tümörü, rhabdomyosacoma tedavisinde kullanılan bir RNA transkripsiyon inhibitörüdür ve Ewing sarkomu 6. Ilk 1964.Triptolide FDA tarafından in vitro ve 30 yıldan beri çeşitli tümör taşıyan hayvan modellerinde incelenmiştir seçici transkripsiyon inhibitörü olan onaylanalı Aktinomisin D, yaklaşık elli yıl kanser terapisinde kullanılmaktadır. 7
corroles amfifilik makrosiklik doğası gibi küçük moleküller veya biyolojik olarak diğer ilaç sınıfları üzerinde önemli avantajlar kazandırırs. 8-14 makrosiklik karakter, büyük moleküller için beklenenden daha büyük olan hücre geçirgenliği sağlar ve bu tür proteinlerin, bu gibi makro-moleküler yüzeyler ile etkileşim için yeterince büyüktür. 8 Corroles biyomoleküller ile sıkı bir kovalent olmayan kompleksler oluşturdukları bilinmektedir ve uyuşturucu. corrole çerçevenin doğal sitotoksisiteye ilaveten, 10, gösterdiğimiz kemoterapötik maddeler için bir taşıyıcı moleküle, özellikle DNA-ara antrasiklin ilaç doksorubisin gibi sülfonatlı corrole vazifesi görür. Sülfonatlı corrole doksorubisin ile birlikte verilmesi, doksorubisin IC 50 olarak 3 misli bir artışı, DU-145 hücreleri için gözlenmiştir. 9 corrole çerçeve kararlıdır ve fonksiyonalize zaman, benzersiz bir absorbans değişimleri maruz doğal emme ve flüoresans özelliklerine sahip Bu tanımlama için kullanılabilir. skafoldun 10 işlevselleştirilmesi doğal affec değilseçici olarak esas itibarıyla biyolojik özelliklerini değiştirebilir corrole çerçevesini değiştirmeden, sülfonatlı corrole ile görüldüğü gibi, corrole, 9-15 fotofiziksel özelliklere t, ancak. 16: Daha önce yedi insan kanser hücresi türlerine karşı altı metallocorroles değerlendirildi. Sonuçlar, insan kanser hücrelerine karşı toksisitesi, belirli metal iyonu, hem de işlevsel grup ikamesine bağlı olduğunu göstermektedir. Örneğin, sülfonatlanmış galyum corroles yüksek hücre alımı deneyimli ve beyin, metastatik prostat kanseri hücrelerinin (DU-145), çekirdeği içine seçici bir şekilde nüfuz; için olandan başka hücre hatları çekirdek içine nüfuz etmez ama aynı corrole, meme için daha büyük bir sitotoksisite göstermektedir (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) ve yumurtalık (OVCAR-3) kanser hücreleri prostat kanseri. 9
Başlangıç hücre bazlı deneyler, bu bileşiklerin bir anti-kanser terapötik maddeleri, hazırda esas olarak ümit göstermiştir göstermektediretki mekanizması içine er soruşturma. Deşifre inhibisyonu bazı organometalik kompleksler 17-27 ile gözlenen ve biz corrole ailenin sitotoksik davranışı için olası bir mekanizma olarak bu süreci incelemek için aranmaktadır. Bu transkripsiyon deneyi canlı hücrelerde bu moleküllerin etkileri hakkında daha detaylı bilgiye götürecek transkripsiyon engellenmesi, değerlendirmek için bir, basit, ucuz ve kolay bir yöntem sağlar.
Burada, galyum transkripsiyon inhibisyonu (III) '5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Şekil 1) test edilmiştir. Bazı geçiş metali komplekslerinin farklı olarak, galyum (III) 'ün bir redoks aktif olduğunu ve bu nedenle, redoks göre metabolik yolların redoks işlemi de söz konusu değildir. 28 Ne olursa olsun, galyum (III)' sitotoksik özellikler göstermektedir ve tedavi edici amaçlar için araştırılmıştır. Galyum platin sonra antikanser tedavi için ikinci en umut verici metal ve birçok çalışmalar ve araştırmalar uğramıştır; nitrat ve klor galyum tuzları hepatoma, lenfoma, mesane kanserleri, ve diğer hastalıklara karşı klinik çalışmalarda değerlendirilmiştir. 29-34 galyum (III) 'ün anti-kanser corrole çalışmalar için idealdir. İlk veriler (bakınız Şekil 2) Ga (tpfc) ve tpfc sahip olan çeşitli kanser hücresi çizgileri ile düşük Gl 50, maksimum hücre çoğalmasının% 50 inhibe etmek için gerekli ilaç konsantrasyonu olarak göstermektedir; Bu onların engelleyici özelliklerini belirlemek için bu iki bileşikler hakkında daha fazla deneyler geçerliliğini teyit eder. Biz ortak antikanser ilaçların Aktinomisin D ve Triptolide bu bileşikleri karşılaştırın. Aktinomisin D intercalates DNA, RNA uzamasını önler ve pikomolar konsantrasyonlarda belli hücre çizgisinde apoptoza neden 6,35-37 Triptolide tümör büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir.; insan XPB / ERCC3, bir alt-birim O bağlananf transkripsiyon faktörü TFIIH RNA polimeraz II aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. 6-7,38-40
Yaygın corroles sitotoksik özellikler gösterdiği bilinir, işlevsellik kaynaklanan farklı mekanizmalar ile ilgili çok az bilgi mevcuttur. RNA transkripsiyonu Corrole engelleme biomacromolecules ile etkileşimlerine daha fazla fikir sunacak. Örneğin dirhodium DNA'ya bağlandığı bilinen diğer kompleksler (II, III) kompleksleri, krom (III) kompleksleri, rutenyum (II) 'polypyridyl kompleksleri, rodyum (III) kompleksleri ve çeşitli diğerleri, 18 RNA transkripsiyon tahlile tâbi tutuldu 27 biomacromolecules ile olan etkileşimleri daha iyi anlaşılması ile sonuçlanır. Bu basit ve yaygın olarak kullanılan deney aynı zamanda, belirli bir molekülün sitotoksisite özelliklerini değerlendirmek ve olmadığını bu yararları daha da biyolojik testler belirlemek için iyi bir başlangıç testidir. RNA transkripsiyon deneyi, aynı zamanda, varyin gibi birçok modifikasyon, sağlargr kullanılan bileşiğin veya bir enzim miktarıdır; inkübasyon süresi, tepkime süresi ve numune zaman noktaları olarak değişiklik göstermesi; ve bu nedenle potansiyel olarak büyük bir veri miktarını sağlayarak, ilgi konusu diğer değişkenler arasında, DNA şablon uzunluğu ve sekansı değişmektedir. Parçalar alınıp ayrı ayrı hazırlanabilir, ancak bu transkripsiyon deneyi, aynı zamanda tüm gerekli reaksiyon bileşenleri ile, uygun kitleri kolayca kullanılabilir. Bu deneylerde, yüksek verim için bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. 41
Agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi: transkripsiyon önlenmesini değerlendirmek için, biz iki yöntem kullanabilirsiniz. Agaroz jel elektroforezi, ayırma tanımlama ve arıtma 0.5- 25 kb'lik bir DNA ve RNA parçaları için basit ve etkili bir yöntemdir. 42. UV-Vis spektroskopisi konsantrasyonuna ve RNA'nın saflığı belirlemek için kullanılabilir. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deney, Ga (tpfc) eklenmesi bilinen DNA bağlayıcı antikanser kompleksleri Aktinomisin D ve Triptolide karşı kıyaslanabilir bir RNA transkripsiyonu inhibe ettiğini ortaya koymaktadır. Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 iM) sitotoksik davranışı onun engelleyici özellikleri nedeniyle olabilir. Herhangi bir transkripsiyon inhibisyonu tpfc görüldüğü için, tpfc sitotoksisitesi RNA transkripsiyon inhibisyonuna bağlı değildir, ancak henüz incelenmemiş başka bir şekilde kaynaklanır.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz içtenlikle jel elektroforezi ile yardım Dr. Cindy N. Chiu teşekkür ve DNA ve sınırlama enzimi onların cömert bağış için Andy Zhou ve Michael Grodick. Biz minnetle ekipman ve malzeme cömert erişim için Profesör J. Heath ve Profesör D. Prober kabul. Biz yararlı öneriler Dr. Karn Sorasaenee teşekkür ederim. Biz video şematik genel olarak kullanılan illüstrasyon oluşturmak için Mary H. Tang teşekkür ederim. Fon Johnson & Johnson ve BDT Y86786 tarafından sağlandı.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
References
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -. L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. 암 연구학. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. 암 연구학. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- . MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- . . Quick Spin Columns Protocol. , (2013).
- . . RNA quality control. , (2007).
- Sabris, R. W. . Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , (2010).
