A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
Des études mécanistiques et thérapeutiques des neurotoxines clostridiennes les présynaptique ciblées (NTC) ont été limitées par la nécessité d'un modèle évolutif, à base de cellules qui produit des synapses fonctionnelles et subit réponses physiologiques à l'intoxication. Nous décrivons ici une méthode simple et robuste de différencier efficacement les cellules souches embryonnaires murines (CES) dans lignages définis de neurones, synapses actives en réseau. Suite à un protocole de différenciation 8 jours, les neurones dérivés de cellules souches embryonnaires de souris (ESN) rapidement exprimer et de compartimenter les protéines neurotypic, forment morphologies neuronales et élaborer des réponses électriques intrinsèques. En 18 jours après la différenciation (DIV 18), ESN présentent glutamatergique active et γ-aminobutyrique (GABA) synapses ergiques et les comportements du réseau émergent caractérisé par un excitateur: équilibre inhibitrice. Pour déterminer si l'intoxication avec NTC antagonise fonctionnellement synaptique neurotransmission, reproduisant ainsi èmee in vivo physiopathologie qui est responsable de manifestations cliniques de botulisme ou le tétanos, la cellule entière patch clamp électrophysiologie a été utilisée pour quantifier courants spontanés miniatures excitateurs post-synaptiques (mEPSCs) dans ESN exposés à neurotoxine tétanique (tente) ou neurotoxine botulique (BoNT) sérotypes / A- / G. Dans tous les cas, ESN présentait une perte presque complète de l'activité synaptique dans les 20 heures. Neurones en état d'ébriété restaient viables, comme l'a démontré inchangés potentiels de membrane de repos et réponses électriques intrinsèques. Pour caractériser davantage la sensibilité de cette approche, les effets dose-dépendante de l'intoxication sur l'activité synaptique ont été mesurés 20 heures après l'addition de BoNT / A. Intoxication à 0,005 pM BoNT / A a entraîné une diminution significative de la mEPSCs, avec une concentration inhibitrice médiane (CI50) de 0,013 pM. Les comparaisons des doses médianes indiquent que les mesures fonctionnelles d'inhibition synaptique sont plus rapides, plus précis et plus sensible que SNAREessais de clivage ou l'essai de létalité de la souris. Ces données valident l'utilisation de souches neurones synaptiquement couplés, dérivés de cellules pour la détection hautement spécifique et sensible de NTC.
L'objectif global de cette méthode est d'évaluer fonctionnellement l'activité synaptique dans les cultures en réseau de neurones dérivés de cellules souches exposées à des neurotoxines de Clostridium. Ce est la première démonstration d'un modèle dérivé in vitro qui reproduit fonctionnellement les pathophysiologies responsables de manifestations cliniques de botulisme et valide ESN comme un modèle approprié pour la détection des NTC, ciblage thérapeutique et études mécanistiques.
BoNTs sont des neurotoxines bactériennes très meurtriers produites par les membres de l'espèce Clostridium. Y compris le récemment proposé BoNT / H, huit sérotypes de neurotoxines botuliques antigéniques distinctes ont été décrites (/ A- / H) 1,2. Tous les sérotypes sont exprimés en 150 kDa peptides qui sont post-traductionnelle entaillées pour produire un dichain composé d'un 100 kDa chaîne lourde (HC) et une 50 chaîne légère kDa (LC) liés par une liaison disulfure 3. Le HC médiation de la liaison aux récepteurs présynaptiques et entry de la toxine dans le neurone par endocytose synaptique. Pendant le traitement endosomal, le HC subit réorganisation structurelle pour former un pore dans la membrane de la vésicule, ce qui facilite la translocation de la LC dans le cytosol présynaptique. La LC ensuite cible spécifiquement et clive récepteur soluble de la protéine de fixation de fusion de -ethylmaleimide sensibles N (SNARE) des protéines dans le compartiment pré-synaptique: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) ou la syntaxine (BoNT / C) 1. Le clivage de l'une de ces protéines SNARE empêche l'assemblage de la machinerie de l'exocytose synaptique, bloquant ainsi la libération de neurotransmetteurs. Cette combinaison de ciblage neuronal efficace et la localisation présynaptique rend BoNTs les poisons les plus puissants connus, avec des doses létales humaine estimée aussi faibles que 0,1 à 1 ng / kg 1.
Des dosages biochimiques peuvent être utilisées pour détecter la présence ou l'activité de CNT LC avec une sensibilité élevée. Cependant, ces méthodes ne parviennent pas à interrogate la capacité de la toxine de se lier, entrez, activer et fonction au sein de neurones, et sont donc des mesures indirectes et éventuellement trompeuses de la présence de la toxine active. En revanche, les tests fonctionnels d'intoxication tels que le test de létalité de la souris (MLA) d'évaluer globalement la capacité de NTC de négocier avec succès toutes les phases d'absorption et d'activation, fournir des évaluations plus pertinentes et spécifiques de l'activité de la toxine. Alors que le député est l'étalon-or de la détection BoNT, ce est une méthode in vivo qui utilise la mort comme un point final et a donc une utilité limitée en tant que plate-forme de recherche. Les tentatives visant à développer des modèles à base de cellules de CNT intoxication propice aux études mécanistes et ciblage thérapeutique ont également subi des limites importantes. Bien que des cultures de neurones primaires offrent un haut degré de pertinence physiologique, leur utilisation est compliquée par un certain nombre de facteurs, y compris le coût élevé des ressources, rendement relativement faible, la présence de multiples sous neuronaletypes et vaste surveillance réglementaire et administratif impliqué dans l'utilisation des animaux. Comme alternative aux neurones primaires, les lignées cellulaires neurogènes (qui peuvent être induits à adopter des propriétés analogues à des neurones par stimulation chimique) telles que les neuroblastomes et les cellules chromaffines surrénales ont été utilisés comme modèles in vitro de l'intoxication. Étant donné que ces cellules sont cultivées en continu avant l'induction, elles sont très évolutif et donc bien adapté pour les approches débit modéré. Cependant, leur pertinence est contestable, car les phénotypes induits sont généralement hétérogènes, sont faiblement sensible à nanotubes de carbone et ne parviennent pas à présenter des comportements neuronaux critiques, y compris l'incapacité de former des compartiments pré- et post-synaptiques qui se assemblent en synapses fonctionnent 4. En l'absence de compartiments présynaptiques physiologiquement intactes, la gamme complète de la toxine: interactions neuronales ne peut être reproduit et donc des mesures fonctionnelles d'intoxication ne sont pas possibles 5. Aucunt étonnamment, tente de mener des études mécanistes ou le criblage de médicaments pour BoNTs utilisant des lignées cellulaires induits neurogène ont abouti à des conclusions qui sont incompatibles avec les études in vivo et de neurones primaires 6.
Il a été proposé que les souches du système nerveux central (SNC) neurones dérivés de cellules peuvent fournir une plate-forme à base de cellules de nouvelle génération pour la recherche BoNT qui combine la pertinence de neurones primaires avec la flexibilité des lignées cellulaires cultivées 7-10. En particulier, les neurones dérivés de cellules souches de souris (ESN) ont été trouvés pour être très sensibles à des doses physiologiques de BoNT / A / G et de reproduire un grand nombre de réponses in vivo à l'intoxication, y compris les persistances différentielles, intoxication activité augmentée, et le sérotype puissances spécifique de 5,8,11. Ces comportements suggèrent que dans les mécanismes in vivo de BoNT absorption, le traitement, le trafic et l'activité sont conservées dans ESN. Cependant, l'inhibition de activit synaptiquey est la manifestation de la signature du botulisme, et donc démontrer une perte de l'activité synaptique suivant l'intoxication par NTC est essentiel avant de conclure que ESN sont appropriés dans le modèle in vitro à base de cellules dérivées d'études de la CNT.
Pour mesurer les effets de l'intoxication avec NTC sur l'activité synaptique, cellule entière patch-clamp électrophysiologie a été utilisée pour quantifier courants monosynaptiques dans 21 + ESN traités avec le véhicule ou DIV CNT-traitée. Nous avons trouvé que l'intoxication de ESN avec BoNT / A / G ou TeNT causé la perte de l'activité synaptique> 95% dans les 20 heures dans tous les cas. Une caractérisation plus poussée effectuée 20 heures après l'intoxication à BoNT / A a montré un effet dose-dépendante de l'activité synaptique, avec une limite de détection en dessous de 0,005 pM et une valeur de CI50 de 0,013 pM. Ces résultats indiquent que le cadre de la détection électrophysiologique d'intoxication sensibilité et l'heure sont considérablement améliorée au cours comparables ana base immuno-lyses de SNAP-25 clivage in vivo et dosages de la létalité de la souris, ce qui démontre que les mesures fonctionnelles de l'intoxication dans des cultures de neurones synaptique actifs peuvent faciliter méthodes plus sensibles, spécifiques et rapides pour caractériser la réponse cellulaire à la BoNT.
La norme de référence actuelle pour la détection CNT, la détermination et la quantification de sérotype est le député. Le MLA interroge l'ensemble de la gamme de l'hôte: clivage interactions de toxine nécessaires pour intoxication à se produire in vivo (par exemple, liaison de la toxine à un récepteur de surface cellulaire, l'internalisation du complexe toxine-récepteur, LC translocation dans le cytoplasme, LC-médiée de substrat et inhibition de la neurotransmission synaptique) 18. Cependant, bien que le député propose un modèle physiologiquement pertinente de l'intoxication, il est gourmand en ressources, peut être confondu par des contaminants et implique un grand nombre de souris avec la mort comme point final. En variante, des dosages à base de cellules pour la détection et la quantification de la BoNT ont été limitées à des cultures de neurones primaires, qui nécessitent également l'utilisation des animaux ou à des lignées de cellules de neuroblastome qui ne parviennent pas à former des synapses et présentent généralement une faible sensibilité à des neurotoxines 8. À ce jour, la plupart des mesures d'intoxication dans edes plates-formes à base de cellules ESE sont appuyés sur la détection du clivage protéolytique de la SNAP-25, VAMP1 / 2 ou la syntaxine-1 11. Cette situation est problématique parce que la protéine SNARE de clivage a été démontré que de façon non linéaire associée à l'inhibition synaptique in vivo et par conséquent peut ne pas représenter exactement intoxication ou la récupération à partir de 19,20 intoxication.
Un système de modèle idéal à base de cellules pour la détection CNT serait (i) être basée neurone; (Ii) être couplé avec synaptique réponses électriques neurotypic; (Iii) être très sensibles à tous les sérotypes CNT ou sous-types; et (iv) l'offre évolutivité, débit et d'analyse des moments qui sont équivalentes ou améliorées au cours de la MLA, à moindre coût, et sans nécessiter l'utilisation d'animaux. Pour répondre à ces exigences, nous avons développé une méthode pour produire de grandes quantités de cultures hautement enrichi, réseau de neurones GABAergiques glutamatergique et disponibles dans le commerce à partir de lignes ESC de la souris. Nous avons ensuite développé le test MIST à quantifierinhibition synaptique en réponse à l'intoxication avec tente et BoNT / A / G. Bien que l'essai MIST peut être réalisée sur une population de neurones des synapses actives (par exemple, les neurones primaires ou des tranches de cerveau), actuellement ESN sont vitro dérivée modèle de neurone que dans cet développe reproductible comportements de réseau émergentes et est donc approprié pour le dosage de MIST.
Produire des quantités suffisantes de neurones de la lignée défini pour les études CNT a nécessité plusieurs innovations dans la culture et la différenciation ESC. Tout d'abord, en sélectionnant pour la culture et les CES qui peuvent survivre suspension adaptation, nous avons éliminé le risque de contamination par des cellules nourricières et la nécessité de purifier les cellules nourricières du CES au début de la différenciation. Bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents suspension adaptation sont inconnues, les CES de suspension adaptés restent mitotiquement actif, conserver Oct3 / 4 expression et continuent d'être neurogène. En utilisant cette méthode, 1,5 x 10 ~ 7 ESC sont généralement récupérés chaque passage. Deuxièmement, la production de NPC a été augmentée de 300% ~ en incorporant une agitation mécanique pour empêcher l'agglomération pendant la différenciation, ce qui augmente l'accessibilité ostensiblement nutriments à l'intérieur des agrégats. Pendant le processus, nous avons constaté que le sérum utilisé pour la culture ESC et la différenciation neuronale est l'élément le plus crucial dans le maintien CES neurogène. Pour un meilleur succès, nous recommandons la suspension adapter cellules ES à chaque lot de sérum et le stockage du sérum à -20 ° C pour soutenir la culture et la différenciation neuronale ESC jusqu'à la date d'expiration.
Comme avec la plupart des cultures synapses actives, DIV 14 + ESN sont très sensibles aux changements brusques de pH, et même une brève exposition à des concentrations atmosphériques de CO 2 peuvent entraîner la neurotoxicité dans les 24 heures. Pour les expériences nécessitant un traitement des cultures suivie par des incubations durables O / N ou plus, les neurones doit être traité directement in l'incubateur ou transférés à une chambre constante CO 2 avant l'expérimentation.
Une variété de techniques confirmé la neurogenèse et la maturation neuronale, y compris CPI, le profilage de la transcription et de cellules entières de patch-clamp électrophysiologie. Les changements temporels dans l'expression génique et la morphologie des neurones étaient compatibles avec une progression rapide à travers les stades de développement de la neurogenèse, et en DIV 16, ESN exposées excitateurs et courants post-synaptiques inhibitrices miniatures avec le réseau émergent de comportements particuliers 16. Preuve de l'activité synaptique suggéré que ESN peut reproduire les pathophysiologies responsables des manifestations cliniques de botulisme et le tétanos. Cela a été confirmé en utilisant MIST pour montrer que l'intoxication BoNT / A / G ou une tente avec facultés affaiblies mEPSC fréquences par> 95% par rapport aux neurones de véhicules-traitée ou non.
Les mesures de la sensibilité du MIST pour BoNT / A indiqué une inhibitrice médianeconcentration (CI50) de 0,013 pM (équivalent à 0,5 souris létale unités / ml) et une limite de détection-dessous 0,005 pM, mesurée à 20 h après l'addition du bain. Sur la base de ces valeurs, MIST est environ deux fois plus sensible au fur et à 2-4 fois plus rapide que le MLA et 30 fois plus sensible que la détection basée sur des immuno-SNAP-25 clivé.
Collectivement, ces données suggèrent que les populations réseau de neurones dérivés de cellules souches offrent un modèle physiologiquement pertinente, à base de cellules d'intoxication. En combinaison avec des méthodes améliorées pour tirer cultures ESN réseau de CES de suspension adaptée, l'utilisation de MIST devrait réduire la nécessité de l'expérimentation animale et les inconvénients associés, les coûts et les préoccupations éthiques de la MLA tout en fournissant une mesure plus rapide, sensible et spécifique de intoxication. L'ensemble de cellules de patch-clamp électrophysiologie est une méthode à faible débit pour identifier la présence de neurotoxines actifs, il offre une résolution et SPEed qui est irréalisable en utilisant des méthodes moléculaires. Ces résultats fournissent également des preuves que l'application des méthodes dépendants de l'activité d'évaluer l'activité synaptique et le comportement du réseau peut permettre la détection rapide et spécifique des neurotoxines. Ces approches plus-débit feraient des études mécanistes, ciblage thérapeutique ou tests de diagnostic possibles pour un large éventail d'agents neuromodulateurs, y compris les NTC.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health Institute national des allergies et des maladies infectieuses (nombre AAI AOD12058-0001-0000) et la Defense Threat Reduction Agency – Bureau technologique conjointe des sciences et de médecine Division S & T (numéros de subvention CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 et CBM.THRTOX.01.RC.014). Cette recherche a été effectuée alors que PB a tenu une réduction Defense Threat Research Associateship prix du Conseil de recherches Agence nationale et KH a tenu une recherche Associateship Prix du Conseil national de recherches. Nous remercions Angela Adkins et Kaylie Tuznik (USAMRICD) pour l'assistance technique; et Cindy Kronman (USAMRICD) pour l'assistance éditoriale. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique officielle du Département de l'Armée, ministère de la Défense ou le gouvernement américain.
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
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0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
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Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
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Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
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Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
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100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
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50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
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Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
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DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
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KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
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NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
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HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
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NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
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Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
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Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
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CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
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Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
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BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
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Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |