Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

De rayos X de imágenes de fluorescencia permite tanto la identidad y cantidad de los elementos presentes en una muestra a ser resuelto espacialmente. Los rayos X incidente, de una energía seleccionado para ser mayor que la energía del elemento más pesado de interés de unión de electrones, superar la energía de enlace de los electrones del centro de la concha al núcleo ^1. Esto crea un "agujero" en la capa de electrones. Como los electrones de mayor energía caen en estos agujeros, rayos X fluorescentes se emiten cuya longitud de onda depende de la separación de energía de esos orbitales. Desde el espaciado de energía de los orbitales es característica de un elemento dado, la emisión de fluorescencia de rayos X también tiene longitudes de onda características, dependiendo del elemento. Es esta emisión a una longitud de onda característica que permite la identificación de los elementos presentes. La calibración de la intensidad de fluorescencia permite la cuantificación de los elementos presentes.

De rayos X microscópicas de fluorescenciay (XFM) se ha convertido cada vez más utilizado, en parte por el desarrollo de fuentes de sincrotrón de rayos X muy brillantes, como los que en primavera-8 en Japón, la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Francia, y el Advanced Photon Source ( APS) en los EE.UU. ^2. Estas fuentes proporcionan haces de rayos X de muy alta intensidad. Al mismo tiempo, las mejoras en la óptica de rayos X, tales como la tecnología de placa de zona, permite la concentración de estos haces a manchas sub-micras, aunque bastante ineficiente ^3. Con vigas de muy alta intensidad, incluso una relativamente pequeña cantidad de luz que puede enfocarse es suficiente para excitar los metales endógenos en las células, la producción de la señal que se puede medir con la tecnología de detectores actualmente disponibles. Por lo tanto, el estudio de la biología química de metales en la célula es una aplicación en particular, que hace uso de muchos de los acontecimientos recientes en esta técnica ^4-10.

Hay muchos factores críticos a tener en cuenta mientras Appacostado XFM para investigar la distribución elemental y cuantificación de células de mamífero cultivadas o de otras muestras biológicas. En primer lugar, la muestra debe mantenerse intacta, tanto estructuralmente como con respecto a su composición elemental, para que la medición sea significativa. En segundo lugar, la muestra también se debe preservar de alguna manera para que sea resistente a los daños de radiación que puede ser causado por un haz de rayos X enfocada. Una manera en que una muestra puede cumplir ambos criterios a la vez se va a congelar rápidamente en una vítreo, hielo amorfo ^11,12. La congelación rápida se logra a menudo a través de diversas técnicas de criopreservación como la congelación de inmersión o de alta presión congelación ^13-16. Es generalmente aceptado que la criopreservación conserva la arquitectura celular general y composiciones químicas en muestras biológicas tan cerca de estado nativo como sea posible. La fijación química, por otro lado, debido a la penetración lenta y selectiva de fijadores en células y tejidos como well cambios posteriores como en la permeabilidad de la membrana, pueden permitir varios iones celulares especialmente los iones difusibles, tales como Cl, Ca y K para ser lixiviado, perdidos o reubicados, haciendo así la investigación de estos elementos subóptimas ^17-19. A pesar de la clara ventaja de la crio-fijación sobre la fijación química en general, para células de mamífero adherentes, en particular, la criopreservación tiene varias limitaciones ^20-23. La más obvia es que no todos los laboratorios de investigación tiene fácil acceso a los instrumentos de criopreservación. La mayoría de los congeladores de alta presión actuales o incluso sumergen congeladores son costosos y propiedad solamente por un subconjunto de las instalaciones criogénicas, que puede ser muy lejos de donde se incuban las células. El beneficio de la criopreservación podría ser objeto de comercio para la desventaja de estrés del viaje colocado en las células. Así, mientras que la crioconservación es sin duda la forma más rigurosa para preservar muestras para el análisis de fluorescencia de rayos X, ciertamente no es el más accesible a todos los investigadores en todas las circunstancias;ni tampoco es siempre esencial – si los metales de interés están estrechamente vinculados a las macromoléculas que se pueden fijar, y la resolución en la que se tomó imágenes de la muestra es mayor que el daño a la ultra-microestructura que pudiera ocurrir durante el secado. Consciente de las advertencias ^24, fijación química y secado pueden ser una buena opción.

Otros factores en el éxito de rayos X experimento de imágenes de fluorescencia incluyen un análisis adecuado. Imágenes de fluorescencia de rayos X es fundamentalmente de rayos X espectroscopia de emisión de fluorescencia combinado con la trama de exploración para proporcionar la resolución espacial. Los espectros de emisión de fluorescencia de rayos X recogidos contienen una combinación de la superposición de picos de emisión, los antecedentes y los picos de dispersión elástica e inelástica del haz incidente. Software que permite la de-convolución de estas aportaciones y en el acondicionamiento de los picos de emisión, ha sido un desarrollo crítico a este campo ^25. También, el desarrollo y la dist comercialribution de normas de capa fina de composición conocida, que se utiliza para calibrar la intensidad de fluorescencia relativa a la cantidad de material, también ha sido muy importante.

Este protocolo proporciona una descripción de la preparación de células adherentes por la fijación química y secado al aire. Un paso vital en este proceso es el crecimiento de las células en las ventanas de nitruro de silicio, que a menudo no se adhieren bien, hacer un enjuague suave en una clave de la moda en particular para el éxito.

Protocol

1. Elaboración de Instrumentos, Sustratos, Medios de Cultivo y platos Manejo de nitruro de silicio (Si 3 N 4) ventanas. Abrir la cápsula ligeramente apretando un extremo que contiene la ventana de una manera tal como para no apretar la propia ventana, mientras gira el otro extremo de la cápsula con la otra mano. Echa un par de reversa, pinzas de punta fina bajo microscopio estereoscópico para asegurarse de que no hay adhesivas, lagunas o dobleces en la punta. De lo…

Representative Results

La capacidad de formación de imágenes de fluorescencia de rayos X para proporcionar información sobre muestras biológicas es contingente sobre estas muestras se preparan de una manera tal que son robustos a daño de la radiación en la escala de tiempo del experimento, y sin embargo, su composición química y sus características estructurales son bien preservado. En ver el resultado de una muestra que ha sido preparado como se describe anteriormente y la imagen, es posible ver que existe una variación en los elem…

Discussion

Imágenes de fluorescencia de rayos X es útil en muchos campos, incluyendo las geociencias, ciencias de los materiales y la biología química ^26-34. Los avances en los rayos X de sincrotrón, y su centrado, han producido vigas de muy alta intensidad. Enfocado de rayos X vigas suficiente para excitar los metales endógenos en las células existen ahora, la producción de la señal que se puede medir con la tecnología disponible actualmente detector de deriva de silicio. Y el estudio de la biología química…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde