JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

ويضم المجمع الأنواع الأنوفيلة الغامبية الملاريا رئيسيا نقل البعوض في أفريقيا. لأن هذه الأنواع هي بهذه الأهمية الطبية، وعادة ما تتميز بعدة صفات باستخدام المقايسات الجزيئية للمساعدة في الدراسات الوبائية. وتشمل هذه الصفات تحديد الأنواع، ومقاومة الحشرات، حالة عدوى الطفيليات، وتفضيل المضيف. منذ السكان من مجمع الأنوفيلة الغامبية لا يمكن تمييزها شكليا، يتم استخدام سلسلة البوليميراز رد فعل (PCR) تقليديا لتحديد الأنواع. مرة واحدة ومن المعروف أن الأنواع، ويتم تنفيذ عدة فحوصات المصب بشكل روتيني لتوضيح المزيد من الخصائص. على سبيل المثال، والطفرات المعروفة باسم KDR في جين الفقرة تمنح مقاومة ضد DDT والمبيدات الحشرية البيروثرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) أو المتصورة كشف DNA الطفيلي المقايسات PCR للكشف عن الطفيليات الموجودة في الأنسجة البعوض. وأخيرا، فإن combinatioن من PCR وتقييد انزيم هضم يمكن استخدامها لتوضيح تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الإنسان مقابل دم الحيوانات) من خلال فحص وbloodmeal البعوض لDNA المضيف محددة. قمنا بتطوير فحص متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل من المقايسات المذكورة أعلاه في واحد متعدد 33SNPs التنميط الجيني رد فعل لمدة 96 أو 384 عينات في وقت واحد. لأن MDA يتضمن علامات متعددة الأنواع، والكشف عن المتصورة، وتحديد الدم المضيف، يتم تقليل احتمال توليد ايجابيات كاذبة أو السلبيات كثيرا من فحوصات السابقة التي تتضمن علامة واحدة فقط لكل سمة. هذا الاختبار قوي وبسيط يمكن الكشف عن هذه الصفات البعوض الرئيسية على نحو فعال من حيث التكلفة وفي جزء من الوقت من المقايسات القائمة.

Introduction

ارابينسيس الأنوفيليس، الأنوفيليس coluzzii والأنوفيلة الغامبية هي ناقلات الرئيسية المسؤولة عن انتقال الملاريا في أفريقيا 1. هذه الأنواع الثلاثة هي شكليا تمييزه 2 و يمكن إلا أن يكون ميزت من قبل المقايسات الجزيئية 3-9. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من المقايسات المصب أجريت بشكل روتيني لمساعدة الوراثة الوبائية والسكان الدراسات. وتشمل هذه (1) مقايسة التنميط الجيني لأنواع جديدة الجزر 10-12، (2) مقايسة التنميط الجيني الاعتراف تعدد الأشكال غير مرادفة في 1014 عشر من الأحماض الأمينية موقف كودون من الفقرة الجين (المقاومة تدق إلى أسفل، أو KDR، SNP) 13 -18، (3) كشف الطفيلي PCR 19-23، و (4) لفحص الحمض النووي المضيف محددة في midguts البعوض 24،25.

وضعنا مقايسة متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل هذه المقايسات إلى رد فعل واحد مع تعدد الإرسال مرماه من هدفalyzing الخصائص المهمة وبائيا لنواقل الملاريا في أفريقيا. ويشمل الفحص MDA علامات متعددة للكشف عن (1) أنواع (A. ارابينسيس، A. الغامبية، A. coluzzii، أو غيرها (أي من) ثلاثة)، (2) مقاومة الحشرات ممثلة في KDR تعدد الأشكال (سواء L1014F وL1014S) ، (3) وجود اثنين من طفيليات الملاريا الكبرى، المتصورة المنجلية وP. النشيطة، و (4) مصدر الدم من الطيور وستة المضيفين الثدييات.

تقليديا، أجريت هذه المقايسات في التفاعلات منفصلة البلمرة المتسلسل. عندما تتم كل هذه المقايسات باستخدام منصة PCR التقليدية، فإنه يتطلب إجراء فحوصات 8-10 PCR رد فعل والمرافق هلام الخطوات الكهربائي. كل رد فعل PCR الفردية من الإعداد إلى النتائج توثيق يأخذ 4-5 ساعة، في حين أن طريقة MDA المقدمة هنا يستغرق حوالي 5 ساعة في مجملها. وهذا يعادل وفورات بنسبة 90٪ في تكاليف العمالة وحدها. قدم MDA هنا يكلف 5 $لكل عينة إلى التركيب الوراثي جميع النيوكلوتايد 33. هذا هو إلى حد كبير أقل تكلفة من فحوصات القائم على هلام الاغاروز واحدة، والتي تكلف نحو 1،50 $ لكل عينة. ان فحوصات الكشف عن الخصائص التي تغطيها MDA تتطلب ما لا يقل عن 8-10 المقايسات القائم على هلام الاغاروز منفصلة بتكلفة 12-15 دولارا للعينة. وعلاوة على ذلك، فإن MDA يقلل كثيرا من فرصة لتوليد كاذبة إيجابية أو سلبية من خلال الاستفادة من ثلاثة على الأقل من علامات لكل الطفيليات أو مصدر المضيف الكشف.

منصة نحن المستخدمة لا يقتصر على نواقل الملاريا ولكن يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات مثل الطب، والطب البيطري، والبيولوجيا الأساسية 26-28. الدراسات جمعية أو علم الوراثة السكانية الدراسات التي تنطوي على كبير (في ترتيب 100S) عدد العينات تتطلب متعمقة المقايسات فعالة من حيث التكلفة لفحص علامات متعددة في وقت واحد. يمكن أن معظم الدراسات التي تستخدم اثنين أو أكثر من المقايسات PCR منفصلة تنفيذ MDA للحصول على نتائج أسرع وبتكلفة أقل. </p>

Protocol

1. PCR التضخيم خلط جميع الاشعال PCR (انظر الجدول تكميلية S1) في microtube 1.5ml. كل SNP اثنين الاشعال (إلى الأمام وعكس). تأكد من أن تركيز الأسهم من كل التمهيدي PCR يتم الاحتفاظ بمبلغ 100 ميكرومتر. تقديم ما يكفي من مزيج التمهيدي ل500-1،000 ردو…

Representative Results

تحديد الأنواع: وفيما يلي 5 النيوكلوتايد تحديد معا ثلاثة أنواع (A. ارابينسيس، A. coluzzii وA. الغامبية) (جدول 4). إذا عينة ليست واحدة من الأنواع الثلاثة، وتعدد الأشكال الثلاثة (01073-213، 04679-157 و10313 -052) تفشل لتضخيم. <p class…

Discussion

ويتكون MDA من خمس خطوات رئيسية هي: PCR التضخيم، رد فعل قلوية الروبيان الفوسفاتيز (SAP)، والإرشاد SNP، تكييف المنتج التمديد، وبمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين – الوقت الرحلة (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي 33-37. أول خطوة التضخيم PCR تضخيم DNA المرافقة كل SNP بحيث DNA قالب يكفي ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكاترة. أنتوني كورنيل ولورا نوريس في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور كاتارينا Kreppel في جامعة غلاسكو لتوفير عينات البعوض من تنزانيا. نشكر السيدة سميتا داس والدكتور دوغلاس نوريس من مدرسة جونز هوبكنز للصحة العامة لتبادل عينات البعوض من زامبيا. كما نشكر السيد لي V. ميون في مختبر علم الوراثة البيطرية للتدريب على تصميم الفحص. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01AI 078183 وR21AI062929.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  31. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  32. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  33. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  34. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  35. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  36. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  37. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  39. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  40. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  41. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  42. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

Multi-detection AssayAnopheles GambiaeMalariaMosquitoesSpecies IdentificationInsecticide ResistancePlasmodium DetectionHost PreferencePCRELISAMultiplex Genotyping
check_url/kr/52385?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image