Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen
Summary
Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Abstract
De Anopheles gambiae soorten complex omvat de grootste malaria overbrengen van muggen in Afrika. Omdat deze soorten zijn van dergelijke medische belang, zijn verschillende karaktertrekken typisch gekenmerkt met behulp van moleculaire tests om te helpen bij epidemiologische studies. Deze eigenschappen zijn onder andere species identificatie, resistentie tegen insecticiden, parasitaire infectie-status, en gastheer voorkeur. Aangezien populaties van Anopheles gambiae complex morfologisch niet te onderscheiden, wordt een polymerase kettingreactie (PCR) traditioneel gebruikt om soorten te identificeren. Als de soort bekend is, worden meerdere downstream assays routinematig uitgevoerd om verdere kenmerken helderen. Zo mutaties bekend als KDR in een para-gen verlenen resistentie tegen DDT en pyrethroïde insecticiden. Daarnaast enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) of Plasmodium parasiet DNA detectie PCR assays worden gebruikt om parasieten in muggen weefsels te detecteren. Tot slot, een gecombinen PCR en restrictie-enzym digesties worden gebruikt om gastheer voorkeur (bijvoorbeeld humane versus dierlijke bloed) door screening van de mug bloedmeel voor host-specifieke DNA helderen. We hebben een multi-detectietest (MDA) dat alle voornoemde assays tegelijk combineren in één multiplex reactie genotypering 33SNPs 96 of 384 monsters ontwikkeld. Omdat de MDA bevat meerdere markers voor soorten, Plasmodium detectie, en gastheer bloed identificatie, wordt de kans op het genereren van valse positieven of negatieven sterk verminderd uit eerdere testen die slechts één marker per kenmerk bevatten. Deze robuuste en eenvoudige test kan deze belangrijke mug karaktertrekken kosten-effectief en in een fractie van de tijd van de bestaande tests detecteren.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii en Anopheles gambiae zijn de belangrijkste vectoren die verantwoordelijk is voor de overdracht van malaria in Afrika 1. Deze drie soorten zijn morfologisch onderscheiden 2 en kan slechts worden verkregen door moleculaire assays 3-9. Daarnaast zijn er vele stroomafwaarts assays routinematig uitgevoerd epidemiologische en populatiegenetica studies steun. Deze omvatten (1) een genotyperingstest voor speciatie eilanden 10-12, (2) een genotyperingstest erkenning van niet-synoniem SNPs in de 1014 ste aminozuur codon positie para-gen (de weerstand knock-down of KDR, SNP) 13 -18, (3) parasiet detectie PCR 19-23, en (4) het screenen op gastheer-specifieke DNA in muggen midguts 24,25.
We ontwikkelden een multi-detectietest (MDA) dat al deze assays in één multiplex reactie met het doel van een gecombineerdalyzing vanuit epidemiologisch oogpunt belangrijke kenmerken van malaria vectoren in Afrika. De MDA assay bevat meerdere merkers voor het detecteren (1) species (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii of andere (geen van de drie)), (2) insecticide resistentie vertegenwoordigd KDR SNPs (zowel L1014F en L1014S) (3) de aanwezigheid van twee belangrijke malaria parasieten Plasmodium falciparum en P. vivax, en (4) het bloed bron van de ene aviaire en zes zoogdiergastheren.
Traditioneel werden deze testen uitgevoerd in afzonderlijke polymerase kettingreacties. Wanneer deze testen worden uitgevoerd met een conventionele PCR platform, vereist het uitvoeren 8-10 PCR reactie assays en bijbehorende gelelektroforese stappen. Elke individuele PCR-reactie van voorbereiding tot het documenteren van de resultaten neemt 4-5 uur, terwijl de MDA hier gepresenteerde methode duurt ongeveer 5 uur in totaliteit. Dit komt overeen met een 90% besparing op arbeidskosten alleen. De MDA gepresenteerde hier kost $ 5per monster om alle 33 SNPs genotype. Dit is aanzienlijk goedkoper dan de single agarose gel gebaseerde testen die ongeveer $ 1,50 per monster kost. Assays detecteren alle kenmerken die onder de MDA zou minimaal 8-10 afzonderlijke agarose gel gebaseerde assays vereisen ten koste van $ 12-15 per monster. Bovendien, de MDA vermindert de kans op het genereren van een vals positief of negatief door gebruik ten minste drie markeringen per parasiet of hostbron detectie.
Het platform we gebruik is niet beperkt tot malariavectoren maar kunnen worden gebruikt in uiteenlopende toepassingen zoals geneeskunde, diergeneeskunde en de biologie 26-28. Diepgaande associatiestudies of populatiegenetica studies met een grote (in volgorde van 100s) aantal monsters vereisen kosteneffectieve screening assays voor meerdere markers simultaan. De meeste studies die twee of meer afzonderlijke PCR assays kunnen de MDA inrichting voor snellere resultaten tegen lagere kosten. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
De MDA bestaat uit vijf belangrijke stappen: PCR-amplificatie, garnaal alkalisch fosfatase (SAP) reactie, SNP uitbreiding, uitbreiding productconditionering en matrix-assisted laser desorptie / ionisatie – time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie 33-37. De eerste PCR-amplificatie stap versterkt DNA flankerende elke SNP zodat er voldoende template DNA beschikbaar zullen zijn bij de SNP extensie stap. De SAP reactie neutraliseert ongebruikte dNTPs die kunnen interfereren met de volgende SNP extensie stap. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Anthony Cornel en Laura Norris aan UC Davis en Dr. Katharina Kreppel aan de Universiteit van Glasgow voor het verstrekken van mosquito exemplaren uit Tanzania. Wij danken mevrouw Smita Das en Dr. Douglas Norris van de Johns Hopkins School of Public Health voor het delen van mosquito monsters uit Zambia. We danken ook de heer Lee V. Millon bij het Veterinary Genetics Laboratory voor het trainen op assay ontwerp. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen R01AI 078.183 en R21AI062929.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
References
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
