ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
神経膠芽腫（GBM）は、最も一般的な原発性悪性脳腫瘍であると常に致命的である。ケア化学療法および放射線療法の非特異的に結合された標準の外科的切除が完全にこの疾患を有する患者における1未満の15ヶ月の予後不良をもたらす、悪性細胞を排除することができない。対照的に、免疫療法は、腫瘍細胞を特異的に標的化するための正確なアプローチを提供し、したがって、担保毒性2-4リスクの減少と非常に効果的な治療プラットフォームとして機能する可能性がある。キメラ抗原受容体（車を）を発現するようにex vivoでを設計し 、T細胞が腫瘍免疫療法のための多目的な戦略を提供します。是正は、複雑な、完全長の主要組織適合性の代わりに、一つ以上の細胞内のT細胞シグナル伝達分子（単数または複数）を有する抗体の細胞外可変領域を融合することによって生成される（MHC）は、T細胞受容体5を拘束性。抗体様抗原のこのモードrecognitiには、反応性の抗原特異的T細胞はMHCの非存在下で認識腫瘍抗原に応答することを可能にし、実質的に無限の抗原レパートリーに適合させることができる。
腫瘍抗原の多様に対して設計さCARのT細胞は、診療所6-9に前臨床有効性と優れた将来性を示している。具体的には、GBM、上皮成長因子受容体変異体III（EGFRvIIIの）、細胞表面10上に発現される腫瘍特異的な変異を標的CAR T細胞プラットフォームの文脈において、神経膠腫を有するマウス11の生存を延長することが示された。汎用性にもかかわらず、しかし、CAR養子療法の臨床的利点は、完全に起因する腫瘍関連免疫抑制および免疫回避12-16ならびに確立およびin vivoで抗原特異的T細胞を維持する際の課題の一部は、実現されていない。免疫療法とケア（SOC）の標準を活用することは、潜在的にこれらのLのいくつかを克服することができる模造品、両方の前臨床および臨床の場で強化された有効性になる。
切除後GBMのためのSOCは、高用量のテモゾロミド（TMZ）、DNAアルキル化剤17、及び全脳照射（WBI）から成る1。これらの治療は、腫瘍MHC発現18-20および死腫瘍細胞17,19,21,22による抗原の脱落のアップレギュレーションを介して、腫瘍ワクチンと相乗作用することが推定される。実際、前臨床設定における免疫ベースの治療法の強化された抗腫瘍効果にTMZ 20,23-またはWBI 18,24リードの追加。さらに、多くの非特異的な細胞傷害性化学療法のように、TMZは、養子療法プラットフォーム27-29に対するホスト空調手段として活用することができる全身リンパ球25,26を引き起こすことが知られている。 TMZ媒介リンパ球枯渇は、ADOPの効力の増大をもたらす、抗原特異的T細胞の頻度及び機能を増強することが示されている頭蓋内腫瘍30に対して電性治療プラットフォーム。 CAR療法の文脈では、リンパ球枯渇は、内因性サプレッサーT細胞31の数を減らし、従って、抗腫瘍活性11,34を増強サイトカイン33削減競争を介して恒常的増殖32を誘導することの両方によってホスト調節手段として機能する。 GBM SOCと免疫療法のプラットフォーム間の相乗関係を考えると、SOCの文脈における新規養子療法とワクチンプラットフォームを評価する有効性に関する意味のある結論を引き出すために重要である。
このプロトコルでは、（処理タイムラインについては図1を参照）のEGFRvIII陽性頭蓋内腫瘍を有するマウスにおけるTMZとWBIと一緒にマウスのEGFRvIII特異CARのT細胞の生成および静脈内投与のための方法を概説する。簡単に言えば、CAR T細胞は、レトロウイルス形質導入によりエクスビボで行われる。ヒト胚腎臓（HEK）293T次いで、細胞を採取し、並行して培養し、活性化マウス脾細胞を形質導入するために使用されるウイルスを生成する（CARベクトルとしたpCL-エコプラスミドを含む）、DNA /脂質複合体を用いてトランスフェクトされる。 CARの生成の過程において、EGFRvIIIの陽性頭蓋内腫瘍を有するマウスのホストは、臨床SOCに匹敵する用量で分画した全脳X線照射および全身TMZ処置を投与する。 CAR T細胞を、lymphodepletedホストに静脈内に送達される。
腫瘍を有するマウスにテモゾロミドの（1）投与、腫瘍を有するマウスの（2）全脳照射、（3）トランスフェクション、（4）、脾臓摘出及びT細胞の調製、（5：以下の手順は、7つの別々の相に記載されている腫瘍を有するマウスに）形質導入、（6）CAR T細胞培養および収穫、及び（7）CARのT細胞の投与。これらの相は6〜7日にまたがると並行して行われるいくつかのステップで構成されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載されている治療のタイムラインはケアの臨床標準をモデル化し、CAR養子療法のためにその効果を活用するために設計されました。 CAR T細胞の用量、TMZ療法、および放射線療法の投与は、in vivoで T細胞活性、リンパ球枯渇、および腫瘍殺傷を増強するように改変することができる。 TMZレジメンは、宿主骨髄破壊及び養子移入細胞の30の増加した膨張を得るため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
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