דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
גליובלסטומה (GBM) היא הגידול במוח הנפוץ ביותר הראשוני הממאיר והוא תמיד קטלני. כריתה כירורגית בשילוב עם כימותרפיה סטנדרטית של טיפול והקרנות שאינם ספציפי לא מצליחה לחסל לחלוטין תאים ממאירים, וכתוצאה מכך הפרוגנוזה עגומה של פחות מ -15 חודשים בחולים עם מחלה זו 1. בניגוד לכך, טיפול חיסוני מציע גישה מדויקת לאופן ספציפי מיקוד תאים סרטניים, ובכך יש לו הפוטנציאל לשמש פלטפורמת טיפול יעילה ביותר עם סיכון מופחת של רעילות בטחונות 2-4. תאי T מהונדסים vivo לשעבר להביע קולטנים אנטיגן chimeric (מכוניות) מציעים אסטרטגיה רב-תכליתית לטיפול חיסוני גידול. מכוניות שנוצרו על ידי פיוזינג האזור משתנה תאי של נוגדן עם מולקולת תא T תאית אחד או יותר איתות (s), במקום histocompatibility הגדול באורך מלא מורכב (MHC) -restricted קולט תא T 5. מצב זה של פרסים והכרה אנטיגן כמו-נוגדןבמאפשר לתאי T אנטיגן הספציפי לתגובתי לזהות ולהגיב לאנטיגנים סרטניים בהעדר MHC ויכולים להיות מותאמים לרפרטואר אנטיגן כמעט אינסופי.
תאי T CAR המהונדסים נגד מגוון רחב של אנטיגנים סרטניים הראו יעילות קלינית ופרה הבטחה מצטיינת במרפאת 6-9. באופן ספציפי, בהקשר של GBM, גרסת CAR פלטפורמת תא T מיקוד צמיחת אפידרמיס קולטן גורם III (EGFRvIII), מוטציה גידול ספציפי הביעה על פני תא 10, הוצג להארכת הישרדות בעכברי נושאי גליומה 11. למרות צדדיות שלהם, לעומת זאת, התועלת הקלינית של טיפול המאמץ CAR לא התממשה במלואו, נובע בחלקו הדיכוי החיסוני גידולים הקשורים והעלמת חיסונית 12-16, כמו גם אתגרים בהקמה ואחזקת תאי T אנטיגן הספציפי in vivo. מינוף הטיפול סטנדרטי (SOC) עם טיפול חיסוני עלולה להתגבר כמה מאלה lחיקויים, וכתוצאה מכך היעילות משופרת בשתי ההגדרה פרה-קלינית וקלינית.
SOC להודעה כריתה-GBM מורכב מtemozolomide במינון גבוה (TMZ), סוכן אלקילציה DNA 17, והקרנת המוח כולו (WBI) 1. טיפולים אלה בחזקתו יתמזגו עם חיסוני גידול באמצעות גברת ביטוי של גידול ביטוי MHC 18-20 ושפיכת אנטיגנים על ידי תאים סרטניים מתים 17,19,21,22. ואכן, התוספת של TMZ 20,23 או WBI 18,24 מוביל ליעילות אנטי-סרטנית משופרת של טיפולים מבוססי חיסון בהגדרה פרה-קלינית. יתר על כן, כמו רבים chemotherapeutics ציטוטוקסיות שאינו ספציפי, TMZ ידוע כגורם 25,26 lymphopenia מערכתי, שניתן למנף כאמצעי למארח-אוויר לפלטפורמות טיפול מאמצים 27-29. lymphodepletion תיווך TMZ הוכח כדי לשפר את התדירות ואת התפקוד של תאי T אנטיגן ספציפי, שמוביל ליעילות מוגברת של adopפלטפורמת טיפול מופרזת נגד גידולים תוך-גולגולתי 30. בהקשר של טיפול CAR, lymphodepletion משמש כאמצעי למארח-אוויר על ידי שני צמצום מספר מדכא אנדוגני תאי T 31, וגרימת תרבות הומיאוסטטית 32 באמצעות הפחתת תחרות לציטוקינים 33, וכך לשפר את הפעילות אנטי-סרטני 11,34. בהתחשב ביחסים סינרגטיים בין פלטפורמות SOC ואימונותרפיה GBM, הערכת טיפולים מאמצים רומן ופלטפורמות חיסון בהקשר של SOC היא קריטית להסקת מסקנות משמעותיות לגבי יעילות.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לדור והעירוי לוריד של תאי T CAR העכבריים EGFRvIII הספציפי לצד TMZ וWBI בעכברי נושאי גידולים תוך-גולגולתי EGFRvIII-חיובי (ראה תרשים 1 לציר זמן טיפול). בקצרה, תאי T CAR נעשים לשעבר vivo על ידי התמרה retroviral. כליה עוברית אנושית (HEK) 293T תאים transfected באמצעות מורכב DNA / שומנים בדם (המכיל את וקטור CAR ופלסמידים PCL-Eco) לייצר וירוס, אשר לאחר מכן נעשה שימוש כדי transduce splenocytes העכברי הופעל שנקצרים ותרבותי במקביל. במהלך דור CAR, מארחים עכבריים נושאות גידולים תוך-גולגולתי EGFRvIII חיובית מנוהלים הקרנה מופרד המוח כולו רנטגן וטיפול TMZ מערכתי במינונים דומים לSOC הקליני. לאחר מכן תאי T CAR מועברים דרך הווריד למארחי lymphodepleted.
ההליך הבא מתואר בשבעה שלבים נפרדים: (1) מנהל של temozolomide לעכברים, (2) הקרנת המוח כולו של עכברים נושאי גידול, נושאי גידול (3) Transfection, (4) כריתת טחול ותא T הכנה, (5 ) התמרה, (6) תרבות תא T CAR וקציר, ו( 7) ממשל תא T CAR לעכברי נושאי גידול. שלבים אלה מורכבים מכמה שלבים שמשתרעים על פני 6-7 ימים ומבוצעים במקביל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ציר זמן הטיפול המתואר כאן נועד מודל הסטנדרטי של טיפול קליני ולמנף את השפעתו לטיפול מאמצת CAR. מינוני CAR T תא, משטרי TMZ, וממשל הקרנות יכולים להיות שונה כדי לשפר את הפעילות בvivo T תא, lymphodepletion, והרג גידול. ניתן להגדיל משטרי TMZ להניב myeloablation מארח והתרחבות מוגברת של תאים הוע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
- Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
- Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
- Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
- Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
- Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
- Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
- Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
- Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
- Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
- Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
- Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
- Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
- Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
- Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
- Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
- Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
- Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
- Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
- Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
- Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
- Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
- Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
- Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
- Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
- Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
- Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
- Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
- Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
- Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
- Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
- Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
- Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).
