Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno primario más común y es invariablemente fatal. La resección quirúrgica junto con estándar no específica de la quimioterapia y la radioterapia cuidado de no eliminar completamente las células malignas, que resulta en un pronóstico sombrío de menos de 15 meses en los pacientes con esta enfermedad 1. En contraste, la inmunoterapia ofrece un enfoque preciso para apuntar específicamente a las células tumorales, y por lo tanto tiene el potencial para servir como una plataforma de tratamiento altamente eficaz con menor riesgo de toxicidad colateral 2-4. Células T diseñadas ex vivo para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) ofrecen una estrategia versátil para la inmunoterapia tumoral. CARs se generan mediante la fusión de la región variable extracelular de un anticuerpo con la molécula de señalización de una o más células T intracelular (s), en lugar de una de longitud completa complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) -restringido receptor de la célula T 5. Este modo de recono antígeno-anticuerpo-comoOn permite para las células T específicas de antígeno reactivos para reconocer y responder a los antígenos tumorales en ausencia de MHC y se pueden adaptar para un repertorio de antígeno virtualmente infinito.
Células T CAR ingeniería contra una variedad de antígenos tumorales han demostrado eficacia preclínica y la promesa excepcional en la clínica 6-9. En concreto, en el contexto de GBM, una variante de crecimiento epidérmico receptor del factor de CAR plataforma de células T focalización III (EGFRvIII), una mutación específica del tumor expresa en la superficie de la célula 10, se ha demostrado prolongar la supervivencia en los ratones portadores de glioma 11. A pesar de su versatilidad, sin embargo, el beneficio clínico de la terapia adoptiva CAR no se ha realizado plenamente, en parte debido a la inmunosupresión asociada al tumor y la evasión inmune 12-16, así como los desafíos en el establecimiento y mantenimiento de las células T específicas de antígeno in vivo. Aprovechando estándar de cuidado (SOC) con inmunoterapia potencialmente puede superar varios de estos limitaciones, resulta en una mayor eficacia tanto en la configuración preclínica y clínica.
SOC para el post-resección GBM consiste en altas dosis de temozolomida (TMZ), un agente alquilante de ADN 17, y la irradiación de todo el cerebro (WBI) 1. Estos tratamientos se presume que en sinergia con vacunas tumorales a través de la regulación positiva de la expresión de MHC tumor 18-20 y el derramamiento de antígenos por las células tumorales muertas 17,19,21,22. De hecho, la adición de TMZ 20,23 o 18,24 WBI conduce a una mayor eficacia antitumoral de los tratamientos de base inmunitaria en el entorno preclínico. Además, como muchos agentes quimioterapéuticos citotóxicos no específicos, TMZ se sabe que causa 25,26 linfopenia sistémica, que puede ser aprovechada como medio de host-acondicionado para las plataformas de terapia adoptiva 27-29. Lymphodepletion mediada por TMZ se ha demostrado para mejorar la frecuencia y la función de las células T específicas de antígeno, lo que aumenta la eficacia de un ADOPplataforma de terapia tiva contra los tumores intracraneales 30. En el contexto de la terapia CAR, lymphodepletion sirve como un medio de host-acondicionado por tanto reducir el número de células T supresoras endógena 31, y la inducción de la proliferación homeostática 32 a través de la competencia reducido para citoquinas 33, mejorando así la actividad antitumoral 11,34. Dada la relación sinérgica entre GBM SOC e inmunoterapia plataformas, evaluar nuevas terapias adoptivas y plataformas de vacunas en el contexto del SOC es crítico para sacar conclusiones significativas respecto a la eficacia.
En este protocolo, se describe un método para la generación y administración intravenosa de células T CAR-EGFRvIII murino específico junto a TMZ y WBI en ratones con tumores intracraneales EGFRvIII-positivos (ver Figura 1 para la línea de tiempo de tratamiento). En pocas palabras, se producen las células CAR T ex vivo por transducción retroviral. Riñón embrionario humano (HEK) 293T células se transfectaron usando un complejo de ADN / lípido (que contiene el vector y los plásmidos CAR PCL-Eco) para producir virus, que luego se utiliza para transducir esplenocitos murinos activados que se cosechan y se cultivaron en paralelo. Durante el curso de la generación de CAR, los anfitriones murinos con tumores intracraneales EGFRvIII positivos se administran fraccionado de todo el cerebro de la irradiación de rayos X y el tratamiento sistémico TMZ a dosis comparables a SOC clínica. Las células T CAR se entregan por vía intravenosa a los anfitriones lymphodepleted.
El siguiente procedimiento se describe en siete fases separadas: (1) La administración de temozolomida a (3) Transfección Ratones portadores de tumores, (2) la irradiación de todo el cerebro de ratones portadores de tumores,, (4) La esplenectomía y células T Preparación, (5 ) Transducción, (6) Cultura de células T CAR y cosecha, y (7) la administración de células T CAR a ratones portadores de tumores. Estas fases consisten en varias etapas que abarcan 6-7 días y se realizan simultáneamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La línea de tiempo de tratamiento descrito aquí fue diseñado para modelar estándar clínico de atención y potenciar sus efectos para la terapia adoptiva CAR. CAR dosis de células T, los regímenes de TMZ, y la administración de la radioterapia pueden ser modificados para mejorar la actividad in vivo de células T, lymphodepletion, y el asesinato del tumor en. Regímenes de TMZ se puede aumentar para producir mielosupresión de host y una mayor expansión de las células transferidas adoptivament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
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