在对小鼠胚胎子宫内心脏番茄凝集素注射到计肾血流量
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
形成和发展肾脏血管（除了肾小球）灌注大大充分研究。作为脉管经由血管生成的发展（其为分支大血管的）和血管（ 从头血管形成），如树脂管型， 在体内超声成像，和显微解剖灌注映射技术在证明之间的亲密关系被限制胚胎内这两个过程和显影肾结构。在这里，我们描述了在小鼠胚胎在子宫内的心内超声引导FITC标记番茄凝集素显微注射的方法，以评估肾灌注的个体发育。番茄凝集素（TL）被灌注在整个胚胎和肾脏收获。组织中共同染色关于各种肾结构，包括：肾祖细胞，肾单位的结构，输尿管上皮细胞，和血管。起始于E13.5大口径血管灌流，但是周边船只仍unperfused。由E15.5和E17.5，小末梢血管以及肾小球开始变得灌注。这个实验技术对于胚胎发育过程中学习脉管和血流的作用是至关重要的。
Introduction
在胚胎发育两个分立的，但同时，血管过程发生：血管生成，该过程从一个主要的预先存在的血管，和血管生成，这是一种新形成血管的来自住宅内皮祖1,2-由此容器增长。分别，前者是同义的血流量，而后者被认为主要是发生在没有它。
同时，以血管形成，肾脏祖细胞的合成，增殖和分化周期性和动态的过程开始展开上9.5天胚胎（E9.5）。在这一点上输尿管芽（UB）侵入背侧到包围后肾间质（MM），并继续直到出生3。反复分支UB进入快速冷凝后肾间质帽开始肾脏的功能单位，肾的形成。随着每一代新UB和NEPH的罗恩，老一辈流离失所到内皮层和髓质的地区，在那里他们再进行内主要血管密集的环境中进一步成熟和分化。就证明了德雷斯勒等人 3，此胚胎过程是由感应信令沉淀，如UB和MM，和细胞外因素3-6无数之间的串扰。最近的两个研究发展胰腺内的细胞外因素和肾脏包括氧张力和血流量7,8。后者将在更详细地相对于肾脏发育中讨论如下。
以暴露所述感应作用血流可能起着肾祖细胞的分化，以及在其他器官的过程，胚胎血流映射的精确和准确的方法是必要的。
计量血流的替代方法包括微升的处方trasound成像及树脂注塑9,10。决定性，这些模式已经被证明是固有地缺乏其能力，以同时地揭开血流之间的时间和空间的并置和干细胞的分化。树脂管型，例如，提供成人组织中血管形成图案的一个有效的模型，然而，在未成熟的血管，如与胚胎的时间点，容器是非常不发达和漏。因此，树脂注塑未能微小的，常常多孔，船内举行。
对于这些明显的障碍，除其他外，我们选择了把超声引导体内心内胚胎番茄凝集素（TL）显微注射到我们的肾发展的调查工作。在此过程中，我们利用超声波探头向同步引导装入微量针填充有2.5微升的TL溶液注入小鼠胚胎在E11.5，E13.5，E15.5和E17.5的时间点左心室。 E170.5是最新的发育年龄为针是没有强大到足以穿透更发达的胚胎。
这种显微注射方法的优点是丰富的。超声引导下注射允许注射针的胚胎左心室内精确定位，被动和控制驱逐溶液进入动物，对心脏的损害最小和周围组织的心脏跳动，并避免突发性心脏衰竭而死亡胚胎前全身灌注。与使用FITC标记TL的，任何灌注脉管将保持沿着其内皮顶膜的标志物。与免疫相结合，利用粘附分子（CD31，血小板内皮细胞粘附分子）和其他各种血管标记，我们能够清楚地灌注和未灌注血管区分，以及表征周围组织中的任何异常染色。
Protocol
Representative Results
Discussion
注射麻醉和时间框架
与关于母亲的麻醉，这是至关重要的，以保持气流不变（2-3升/分钟），并在低的PSI。镇静药流必须在约1.75-2升/分举行。同时，时间安排在注射发生必须密切监测和控制与每个垃圾。对于每一个垃圾注射过程应保持在45分。这一时限是极为重要的实验，因为每个胚胎必须保持恒定，正常的心脏速率的范围内，以促进在整个身体和感兴趣器官受控和恒定的灌?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
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