マウス胚に子宮内 、心臓内トマトレクチン注射では腎血流量を測定する
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
腎臓の血管（離れて糸球体からの）開発の形成と灌流が大幅に代役されている。脈管構造は、（主要な血管の外分岐される）は、血管形成および脈管形成（ 新生血管形成）を介して発展するにつれて、そのような生体内超音波イメージングの樹脂キャスト、および顕微解剖として灌流マッピング技術との間の密接な関係を実証するが限定されているこれら二つのプロセス及び胚内の腎臓の構造を開発。ここでは、腎臓の灌流の個体発生を測定するためにマウス胚に子宮内心臓超音波ガイド下FITC標識トマトレクチンマイクロインジェクションでの手順を説明します。トマトレクチン（TL）は、収穫胚および腎臓を通して灌流した。ネフロン前駆細胞、ネフロン構造、尿管上皮、および血管系：組織を含む様々な腎臓構造に共染色した。 E13.5から始まる大口径容器は、しかし、末梢灌流した船がunperfused残った。 E15.5およびE17.5では、小さな末梢血管だけでなく、糸球体は、灌流さになることを始めた。この実験的手法は、胚発生中の脈管構造と血流の役割を研究するために重要である。
Introduction
胚発生中に2つの別々の、まだ同時、血管のプロセスが行われます。血管新生、血管が住宅内皮前駆細胞1,2から血管のデノボ形成であり、主要な既存の容器、および脈管形成、から成長するプロセスを。後者は、主にそれが存在しない場合に起こると考えられている間に、それぞれ、前者は、血流と同義である。
血管形成への同時、腎臓前駆細胞合成、増殖、および分化の循環的かつダイナミックなプロセスは、胎生9.5（E9.5）上で展開を開始します。この時点で、尿管芽（UB）は、周囲の後腎間葉（MM）に背側に侵入し、出産3まで続く。急速に後腎キャップ間充織を凝縮にUBの繰り返しの分岐は腎臓の機能ユニットの形成、ネフロンを開始します。 UBとnephのすべての新世代ロンは、古い世代は、それらが、その後、主に血管密度の高い環境内でさらに成熟と分化を受け、内側皮質と髄質の地域、にずれている。ドレスラーらによって証明されるように、図3に、この発生学的プロセスは、UBとMMとの間のクロストーク、および細胞外因子3-6無数のように、誘導性シグナル伝達により沈殿させる。開発膵臓と腎臓内の二つの最近調査し、細胞外の要因は、酸素緊張と血流7,8が含まれています。後者は、腎臓の発生に関連して以下でさらに詳細に説明する。
血流は、潜在的ネフロン前駆細胞の分化、並びにの他の器官形成プロセス、胚血流マッピングの精密で正確な方法で果たす役割の誘導を露出させるために不可欠である。
血流を測る別の方法は、ulの処方を含むtrasoundイメージングと樹脂が9,10を投げかける。結論的に、これらのモードは、本質的に同時に、血流との間の時間的及び空間的な並置を発表し、幹細胞の分化する能力に欠けていることが示されている。レジンキャストは、例えば、成体組織内の血管パターニングの有効なモデルを提供する、しかしそのような胚の時点と同様に未熟船、で、血管が肉眼的に未発達及び漏出性である。そのため、樹脂は、しばしば多孔質の、小さな血管内に保持することができないキャスト。
これらの見かけ上の障害のために、とりわけ、我々は超音波ガイド下腎臓発生の私たちの調査に生体内で心臓内胚トマトレクチン（TL）マイクロインジェクションに組み込むことを選んだ。この手順では、同期E11.5、E13.5、E15.5およびE17.5の時点でのマウス胚の左心室にTL溶液2.5μlので満たされたマイクロピペット取り付けられた針を案内するために超音波プローブを利用する。 E17針がより発展した胚を貫通するのに十分な強さではありませんように0.5は、最新の発達時代です。
このマイクロインジェクション法の利点は豊富である。超音波ガイド下マイクロインジェクションは、動物の鼓動する心臓への胚性左心室、ソリューションの受動的かつ制御追放、心臓や周辺組織への最小限のダメージ、との突然の心不全と死の回避内注射針の正確な位置決めが可能胚全身灌流の前に。 FITC標識TLを使用することで、すべての灌流し、血管系は、内皮頂端膜に沿ってマーカーを維持します。免疫組織化学と組み合わせて、PECAM（CD31、血小板内皮細胞接着分子）、および様々な他の血管マーカーを利用して、我々は明らかに灌流および非灌流血管を区別するだけでなく、周囲の組織の任意の異常な染色を特徴付けることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
マイクロインジェクション麻酔と時間枠
母親の麻酔に関しては、それは気流定数（2-3 L /分）と低PSIに保つことが不可欠である。鎮静剤の流れは、約1.75から2 L / minで保持されなければならない。同時に、注射が行われている時間枠を綿密に監視し、各ごみとのために制御されなければならない。各ごみための注射の手順は45分以下に抑えます。各胚が身体と関心のある器?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
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