Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы, представленные в этом протоколе были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного.
1. Подготовка операционного стола
- Настройка грелку с рециркуляцией теплую воду на операционном столе, под микроскопом рассечение. Поместите нержавеющей стали опорную плиту на грелку. Поместите стерильную абсорбирующей прокладки на опорной плите и грелку.
- Упорядочить стерильные хирургические инструменты на соседней стерильной впитывающей прокладки. Соберите две пары угловых щипцов остроконечного, две пары угловых щипцов, три гемостаза щипцы, два преднатяжители провода, небольшие хирургические ножницы, микро-ножницы, один ангиопластика провода (диаметр 0,15 дюйма) и три 6-дюймовых сегменты 6,0 шелковой нити ,
- Изгиб круглый конец проволоки ангиопластики, чтобы соответствовать кривизне бедренной артерии. Это будет легче продвигать провод во время операции.
2. ПолучениеМышь для хирургии
- Обезболить мыши при непрерывном вдыхании 2,5% изофлуран. Будьте уверены, чтобы следить за состоянием животного в течение всей процедуры. Выполните проверку щепотку пешком мыши, чтобы подтвердить, что он полностью под наркозом. Убедитесь, что животное не двигается, когда тест щепотку вводят.
- Нанесите смазочных мазь для глаз животного, чтобы предотвратить высыхание. Безопасный животное в положении лежа на спине на абсорбирующей прокладки с использованием хирургической лентой. Продолжить введение 2,5% изофлуран через носовой конус.
- Использование Крем для депиляции, удаления мех от ноги и живота в середине линии. Промыть кожу водой с мылом. Депиляция может быть выполнена за один день до операции. Обратите внимание, что чрезмерное лечение с кремом могут привести к раздражению кожи.
- Непосредственно перед операцией, применять повидон-йод в депилированной области с ватным наконечником аппликатором для стерилизации кожи. Промойте депилированной кожу с 70% этанола и сухойсо стерильным ватным аппликатором. Повторите 3 раза.
- Администрирование дооперационное дозе 5 мг / кг карпрофена с помощью подкожной инъекции.
3. Выделение бедренной артерии
- Использование малых хирургических ножниц, чтобы изогнутый разрез в коже по сравнению с бедренной артерии. Грубо рассекают и закрепите окружающих тканей с помощью преднатяжители магнитного втягивающим фиксаторы, чтобы найти бедренную артерию. Смочите ткань, периодически используя физиологический раствор для орошения Применить физиологический раствор, используя стерильный ватный-аппликатор.
- Изолировать бедренную артерию с помощью пинцета. Аккуратно отделить нерв из сосудистого пучка с помощью остроконечного пинцета. Избегайте прокалывания вены, и не повредить нерв. Нажмите нерв от расслоения, чтобы избежать стимулировать ее.
- Осторожно отделить бедренную вену из бедренной артерии, бедренной локализации бифуркации. Область бифуркации особенно трудно анализировать.
- Posterior к развилке, петля 6,0 шелковой нитью под бедренной артерии и закрепите кровоостанавливающего. Это проксимального шва будет использоваться для ограничения кровотока в артерии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует небольшое изменение в связи при осуществлении способа перевязки по сравнению с методом прижигания (см рисунок 1 и рисунок 2). - Дистальнее бифуркации, петля 6,0 шелковой нитью под бедренной артерии и безопасным, с кровоостанавливающего. Это дистальные вспомогательные шов в позиционировании артерии.
- Loop два швы под мышечной ветви бедренной артерии, предварительно связать их и зафиксируйте с помощью кровоостанавливающего. Не забудьте увлажнить ткани с физиологическим раствором. При выполнении метода прижигания раны провода, только один петлевой шов приходится на мышечную отрасли.
4. Выполнение бедренной артерии Wire травмы
- Ограничить кровоток в бедренной артерии, потянув за проксимальный шов. Слегка потяните дистального Hemostна и кровоостанавливающего обеспечения отрасли, чтобы выставить участок для артериотомии. Перевязывать мышечная ветвь, связывая нити вокруг него.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подъемные артерию вверх будет более эффективно ограничивать поток крови, чем тянуть горизонтально в одиночку. - Отрежьте небольшой филиал с прижиганием между двумя швами. Использование микро-ножницы, выполнить артериотомии в боковой ветви бифуркации. Используйте пинцет, балансируя на рулон хирургической лентой, чтобы стабилизировать микро-ножницы.
- Подтвердите присутствие артериотомии с помощью остроконечного пинцета. Аккуратно поднимите открытие артериотомии с щипцами. Представьте закругленным концом провода в артериотомии с помощью щипцов. Чтобы облегчить продвижение проволоки, добавить одну или две капли лидокаина в области с помощью шприца.
- Когда проволока достигает проксимального шва, освободить нить и регулировать так, чтобы она не может препятствовать продвижению проволоки. Вставьте провод до тех пор, пока не могу продвигаться дальше. Кончик-гое провод должен останавливаться в области паховой связки.
- Разрешить провод оставаться в бедренную артерию в течение одной минуты. Через одну минуту отказаться и продвигать провода в движении пильной десять раз травмировать и оголять эндотелий бедренной артерии. Для травмы меньшей тяжести, уменьшить количество раз провод вытягивается и из артерии или оставить провод в артерии только для 1 мин.
- Уберите провод медленно. Когда вокруг конец проволоки прошел проксимального шва, ограничивать поток в артерии, потянув за проксимальный шов. Уберите провод полностью.
5. лигирования мышечная ветвь
- Затяните оставшиеся шов на мышечной ветви. Это позволит предотвратить кровотечение из артериотомии. Вернуться поток для мышечной ветви, и убедитесь, что кровь не вытекающее из него. Обрезать концы от швов на мышечную отрасли.
6. Альтернативный метод: Локализованные Кауризации в артериотомии
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный подход может быть принято, чтобы избежать перевязки мышечной отрасли и позволяют сосудистого доступа через большие основной бедренной артерии.
- Начиная с 4,1, ограничивают поток в бедренную артерию, потянув на ближнем шва. Потяните дистального шва и шва удерживающий мышечная ветвь слегка обнажить участок для артериотомии (рисунок 1 и рисунок 2).
- Использование микро-ножницы, выполнить артериотомии в точке ветвления бедренной артерии и мышечная ветвь. Если разрез сделан в сторону артерии, что может быть проще, чтобы выжечь. Используйте пинцет, балансируя на рулон хирургической лентой, чтобы стабилизировать микро-ножницы.
- Чтобы проверить успешность прижигания, восстановить поток к бедренной артерии, ослабив проксимального шва. Если кровотечение происходит от артериотомии, повторите прижигания. Если прижигание успешно, поток крови будет вновьхранятся дистальнее артериотомии.
- Представьте провод и выполнить травмы провода, как описано в разделе 4.
- Продолжить ограничение кровотока в бедренную артерию. Нагрейте прижигания остроконечный по крайней мере 6 дюймов от мыши. Как наконечник прижигание охлаждает, применять его слегка сторона артериотомии, чтобы закрыть разрез.
- Чтобы проверить успешность прижигания, восстановить поток к бедренной артерии, ослабив проксимального шва. Если кровотечение происходит от артериотомии, повторите прижигания. Если прижигание успешно, поток крови будет восстановлен дистальнее артериотомии. Удалите временную проксимального и дистального связей.
7. Имплантация Периваскулярный Drug Delivery Patch
- Создать периваскулярной патч наркотиков может быть создан, как описано в предыдущих исследованиях 11 или с использованием аналогичных методов. Тупая углы барьерного области доставки лекарств патч с использованием стерильных ножниц
- Поместите доставки лекарственного погладитьч на потерпевшего бедренной артерии с наркотиками выпускать стороне, обращенной к артерии. При необходимости, используйте пинцет, чтобы улучшить положение патча.
8. Закрытие ран и восстановление
- Закройте рану с простым прерванной нити, состоящей из квадратных узлов. Прерывистый шов продлевает закрытие раны в случае животных пытается удалить шов.
- Выключите анестезии и удаления животного из SET UP. Разрешить животных для восстановления на потепление площадку.
- Продолжайте следить за восстановление мыши. Проверить разреза каждый день, чтобы убедиться, что он остается закрытым. Для лечения послеоперационной боли, вводить подкожную инъекцию 5 мг / кг каждые 12 Carprofen ч после операции и затем каждые 12 ч в течение 2 дней. Если боль продолжается за пределы первоначального 2 дней, обратитесь к ветеринару для направления по дальнейшему обезболивающего.
9. Сбор бедренных артерий для гистологии
- В 28 дней после операции, выполните углерода эвтаназию диоксида мыши.
Примечание: подходит скорость потока двуокиси углерода должно сместить 10-30% камере в минуту, и будет варьироваться в зависимости от размера камеры, используемой. Резка диафрагмы и сердечной пункции должна быть выполнена в качестве вторичного метода эвтаназии. - Безопасный мышь в положении лежа на спине с помощью хирургической лентой. Сделайте надрез над бедренной артерии, где была сделана первоначальная хирургический разрез.
- Для обоих потерпевшей артерии и неповрежденной артерии от противоположной ноги, прямо рассекать и закрепите окружающих тканей с помощью втягивающих и магнитные втягивающим фиксаторы, чтобы найти бедренную артерию. Смочите ткань, периодически используя физиологический раствор для орошения. Применить физиологический раствор, используя стерильный ватный-аппликатор. Будьте осторожны, чтобы не повредить артерию.
- После бедренную артерию был выделен из места первоначального артериотомии в брюшной аорте, связать SEGния из шелковой нити вблизи исходного сайте артериотомии. Это шов поможет определить наиболее дистального конца бедренной артерии и облегчить обработку образца.
- Использование микро-рассечение ножницами, чтобы вырезать бедренную артерию. Сделать один разрез дистально по отношению к шву. Сделать другой разрез на противоположном конце бедренной артерии, рядом с брюшной аорты.
- Передача вырезали артерии к стеклянной чашке Петри, содержащей физиологический раствор. Рассеките артерию дополнительно, чтобы удалить избыток соединительной ткани или жира. Аккуратно удалите кровь из просвета путем промывания физиологическим раствором.
- Передача артерии во флакон 10% забуференном формалине. Хранить флакон при 4 ° С с нежным качалки в течение 48 ч.
- Передача фиксированного артерии до 70% этанола, чтобы хранить, пока не будет обработан для гистологии.
- Код для вставки артерию в парафиновые блоки и секции блоков для окрашивания.
- Выполните гистохимическое и иммунохимическое окрашивание для оценки степени повреждения и интимной гипerplasia.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для представительных результатов, мы использовали гематоксилином и эозином для визуализации ядер и общей морфологии или Pentachrome пятно Movat к себе упругую пластинки и другие артериальные компонентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После травмы проволоки, гиперплазии неоинтимы со временем развивается и, как правило, рассматривается в течение 14 до 28 дней. Методы, описанные в данной работе, приводят к надежной генерации гиперплазии интимы у мышей, как показано гистологические результаты на фиг.3. Неповрежденной бедренную артерию продемонстрирует интактный упругой пластинки и нормальную толщину и длину окружности. Ранения бедренной артерии покажет гиперплазии интимы, ухудшение упругой пластинки и продемонстрировать повторного эндотелиализацию в более поздние моменты времени. Re-эндотелизации обычно завершается на отметке 21 дней, но это зависит от фонового штамма мышей используются и могут быть оценены с использованием иммунного окрашивания эндотелиальных маркеров на участках или, предпочтительно, измеренных на фас препаратов с использованием синего красителя в Эвана, сканирующей электронной микроскопии или иммунным с конфокальной микроскопии на фас препаратов артерии. 17,18 Для количественного гиперплазии интимы этоЛучше всего для измерения площади интимы или соотношение интимы-на-СМИ на трех участках вдоль поврежденной артерии для учета потенциальных изменений по длине потерпевшей области артерии.
Рисунок 1: Фотографии критических шагов двух методов травмы провода в бедренную артерию сравнение шагов для метода лигирования (наверху) с методом прижигания (внизу) для выполнения травму провода.. В методе перевязки, два швы, крепящие мышечная ветвь предварительно связали, чтобы они могли быть затянуты для лигирования мышечная ветвь. Дистальнее из двух мышечная ветвь швов затянуты. Артериотомию и провод вставки выполняются в мышечной ветви. После травмы выполняется, а остальные шва на мышечной ветви затягивается и обрезается. В методе прижигания, только один сuture оборачивается под мышечной ветви. Артериотомию и установка проволоки выполняются в точке ветвления мышечной ветви от бедренной артерии. После травмы выполняется, разрез обезболивающий укол без лигирования либо бедренную артерию или мышечную ветвь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: большее увеличение фотографии важных шагов двух методов травмы проволоки сравнение Крупным планом шагов для метода лигирования (наверху) с методом прижигания (внизу).. Расположение артериотомии в разграничены с пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенноефигура.
Рисунок 3:. Характерные гистологические результаты травмы проволоки 14 дней после процедуры гистологического из разделов артерий окрашивали гематоксилином и эозином (вверху) и pentachrome окрашивания Movat в (внизу). Маркированный в изображении просвета (L), интима (I) и упругой пластинки (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W.
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A.
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
