BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석
Summary
We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.
Abstract
The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB’s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.
Introduction
Granzymes 자연 킬러 (NK) 세포 및 세포 독성 T 림프구 (CTL) (1)의 분비 리소좀에서 발견되는 세린 프로테아제 패밀리이다. 다섯 가지 granzymes 인간 (A, B, H, K 및 M)에 존재하고, 마우스에서 십 (A – G, K, M 및 N) 2,3-. 그랜 자임과 그랜 자임 B (GzmA, GzmB)는 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 설치류 설정에서 조사되었다.
GzmB의 고전 함수는 표적 세포 사이토 졸로 액세스 4 그랜 자임을 허용 기공 형성 단백질 퍼포과 함께 실행되는 표적 세포에서 아폽토시스의 유도이다. GzmB 발현 명백하게 세포 상해 성 림프구에서 발견되지만, 최근의 연구는 호염기구 (6), 비만 세포 (7) 형질 수지상 세포 (8) 및 B 세포 (9)를 포함하지만, 케 라티노 사이트 (5)에 한정되지 않고, 다른 GzmB 발현 세포 유형의 다양한 어드레싱되었습니다 10.이러한 맥락에서, 비 세포 사멸 GzmB 기능은 염증 과정, 조직 리모델링과 다른 면역 특성 11-14 참여에 이르기까지 드러났다.
폭 넓은 생물학적 역할이 이전에 의심보다 GzmB 제안 된 것을 감안할 때, 연구자는 검출 신뢰성과 특정 도구가 필요합니다. 이점 진핵 세린 프로테아제 (15) 사이에서 고유 아스파르트 산 잔기, 속성의 카복실 측 쪼개지 GzmB의 특정 요구 사항이다. 마우스는 인간과 쥐 GzmB 그러나 마우스 GzmB의 확장 기질 특이성 터미널 (P1)에서의 ASP와 특정 일반 기판 GzmB 효율적으로 절단 할 수 있음을 의미 모두 인간과 쥐 16과는 미묘하게 다른, 구조적으로 매우 유사 세 종, 상류 P1의 더 복잡한 시퀀스와 다른 기판 반면 널리 변수 결과를 제공 할 수 있습니다. 과거 최신 리튬 둘terature,이 사실은주의 깊게 통제에도 불구하고, 상당한 혼란과 일부 실험 결과의 생물학적 의미의 오해가 발생했습니다, 운동 연구는 상황 (17)를 해결하기 위해 노력했다.
이 논문에서 우리는 두 가지 상업적으로 이용 가능한 기판, 즉 BOC-알라 – 알라 -의 ASP SBzl 및 N- 아세틸 일드 서열 1 프로의 ASP-P-니트로 아닐리드를 사용하여 이러한 점을 설명하기 위해 노력했다. 이 시약은 분열 (형광 무료 paranitroanilide 대 무료 sulphydryl) 다음과 같은 서로 다른 반응 그룹을 생성 할 수 있지만,이 단백질 분해 분열에 영향 무엇이든이 없습니다. 기술 된 프로토콜은 매우 오래 프로토콜 (18)의 현대 적응이지만 또한 GzmA 및 GzmH 다른 granzymes의 활성을 검출하기위한 방법 론적 틀을 제공하면서 조사관, 적절히 다른 GzmB 기판을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
역사적으로 granzymes은 표적 세포의 급속한 세포 사멸 죽음을 유도 할 수있는 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 이펙터 분자로 확인되었다. 이는 아스 파르 테이트 (D) 잔기에 타깃 기판 분자를 절단함으로써 그 하류 표적 여러뿐만 아니라, 모두 절단 프로 카스파하여 카스파 제 캐스케이드를 활성화 할 수 있었다 GzmB의 작용에 주로이었다. 그러나, 지금 GzmB 발현 림프구 세포 독성 세포에 국한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Comment/description |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
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