전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
엑소 좀은 세포 간 의사 소통의 매개 역할을 microvesicular 구조입니다. 그것은 그들이 질병 차별적 인 바이오 마커를 가지고 있는지 확인 엑소 좀의 내부화물을 연구하는 관심입니다. exosomal 분석을 수행하기위한, 그것을 추출하여 내부 콘텐츠를 손상시키지 않고 타겟 biofluids에서 엑소 좀을 분석하기위한 방법을 개발하는 것이 필요하다.
전계 방출 유도 및 측정 (EFIRM)는 구체적 biofluids에서 엑소 좀을 추출 그들의화물을 하역하고, 내부 RNA / 단백질 함량을 테스트하기위한 방법이다. 항 인간 CD63에 특이적인 항체를 사용하여 자성 미립자, 엑소 좀은 제 biofluids으로부터 침전된다. 다음 추출, 저전압 전기 순환 구형파 (CSW)는 기공을 막 중단 및화물 하역의 원인에 적용됩니다. 엑소 좀의 함유량 …로서 대한 전극 표면에 고정화 DNA 프라이머 또는 혼성화 항체분자 내용의 ntification.
EFIRM 방법은 용해 완충액없이 분석 엑소 좀의 추출 및 언화물 유리하다. 이 방법은 엑소 모두 RNA와 단백질의 특이 표적 바이오 마커 검출을 수행 할 수있다. 크기 기반의 기술과 반대로 EFIRM 특히 그 표면 마커에 기초하여 엑소 좀을 추출한다.
투과 전자 현미경 (TEM) 분석은 엑소 및 캡쳐 및 분석을위한 방법의 기능을 설명한다. EFIRM 방법은 인간 폐암 H640 세포를 주입 구 마우스의 분석 식염수 컨트롤을 수신 (11) 쥐에 대해 자신의 엑소 프로파일을 테스트하기 위해 (엑소 마커 인간 CD63-GFP를 발현하는 형질 감염된 세포주) exosomal 도포 하였다. exosomal 바이오 마커의 상승 된 레벨 (참고 GAPDH 유전자 및 단백질 표면 마커 인간 CD63-GFP)는 H640 모두 혈청 및 타액 샘플 주입을 위해 쥐를 발견 하였다. 또한, SalI로버지니아 및 혈청 샘플은 선형성 (R = 0.79)가 입증되었다. 이러한 결과는 말초 질환의 검출을위한 타액 엑소 바이오 마커의 실행 가능성에 대한 암시이다.
Introduction
엑소 조사 RNA 1, 2 DNA 및 단백질 3화물을 운반 지질 마이크로 소포를 검사 조사의 새로운 분야입니다. 엑소 생물학의 이전 조사는 혈액 4, 소변 5, 모유 6, 침 7로 biofluids에서 엑소 좀의 식별을 주도했다. 연구는 원격으로 본체 (8)의 서로 다른 시스템 간의 통신을 명상, 엑소 좀 다른 세포질 통로에 역할을한다는 것을 증명하고있다. 역할의 엑소 좀은 세포 간 통신에서 재생하기 때문에, 그들이 질병 상태와 상관 생체 분자 표적 (단백질, RNA 및 DNA)를 패키지 가설이 성립된다. 시험관 3 및 동물 모델 (9) 연구는이 가설을 확증하기 위해 나타납니다. 바이오 마커 발견에 대한 콘텐츠를 조사 exosomal, 그것은 선택적 엑소 biofluids로부터 격리를위한 방법론을 개발하는 것이 필요하다, 유도 expulsi엑소 좀에서화물 및 엑소 생체 분자의 정량에. 이 일의 범위에서, 엑소 좀은 구조가 약 70 ~ 100 nm의 직경을 갖는 표면 마커 CD63을 갖는 것으로 정의한다.
연구진은 일반적으로 첫 번째 초 원심 분리 (10)에 의해 엑소 좀을 정화하고 용해 버퍼 키트의 사용을 통해 exosomal 내용을 처리합니다. 용해 버퍼 방법의 사용은 분에서 시간에 이르기까지 배양 시간이 필요합니다. 이 과정은 잠재적으로 엑소화물을 손상 및 열화를 샘플링 될 수 있습니다. 예를 들어, 주변의 세포 외 환경으로 용해 완충액을 통해 방출 타액 엑소의 RNA는 exosomal의 RNA 후 – 용균 측정 안정화 시약 (11)의 첨가없이 특히 어려운 태스크를 버퍼링하게 1 분 아래의 반감기를 갖는다. 용해 및 안정화를위한 다양한 시약을 추가하는 복리 효과는 복잡 에이전트를 소개하고 analy을 방해 할 수 있습니다exosomal 내용의 동생. 또 다른 방법은 빠르게 exosomal 내용을 하역하고 안전하게 특성에 대한화물을 보존 도움이 될 수 있습니다.
본 연구에서는 exosomal 콘텐츠 릴리스 불균일 전기장의 사용을 제안한다. 전기 필드는 편광 및 세포막을 형성하는 지질 이중층을 방해하는 기능을 수행하는 것으로 알려져있다. 우리의 실험 작업은 엑소 좀의 마이크로 소포 구조를 방해하고 수행화물을 해제하기위한 비 균일 순환 구형파 (CSW)의 사용을 탐구한다. 이 방법은 대부분의 생체 분자가 중단되지 않을 것임을 의미하는 수백 밀리 볼트 범위의 전압을 사용합니다. 우리는 환상 구형파의 사용량이 주변 환경으로의 유체 타액 엑소 mRNA의 함량의 방출을 작동 할 수 있다는 것을 입증한다. exosomal 함량이 릴리스 원활 바이오 마커의 발현 정도를 정량화하는데 사용될 수있다 전극 시스템과 통합되어 12,13.이 제안 된 방법은 엑소 콘텐츠의 빠른, 민감한, 그리고 용해 버퍼 무료로 분석 할 수 있습니다.
EFIRM 워크 플로우 1. 개요를 그림.. EFIRM 방법은 크게 정화 및 분석 엑소 좀에 필요한 세 가지 주요 단계로 구분된다.
이 CSW exosomal 기반 컨텐츠 방출 및 분석 방법은 엑소 격리를위한 자기 고유의 CD63 마이크로 비드와 함께 사용된다. 이러한 CD63-친화 비즈 타액 샘플 (및 기타 biofluids)에서 엑소 좀의 선택적 분리를 위해 할 수 있습니다. 인큐베이션과 자화 비드 엑소 좀을 이용하여 추출 후, 비드는도 1. 컨텐츠 방출 실험과 분석을 기초 부 CSW위한 전기 화학적 센서 시스템으로 마이그레이션 작업의 개요를 제공 아르EFIRM 방법의 흐름.
Protocol
Representative Results
Discussion
결과가 나타내는 바와 같이, 항 인간 CD63 코팅 된 자성 나노 입자는 특히 70 ~ 100 nm의 범위의 크기를 갖는 작은 입자를 포착 할 수있다. 이 캡처 된 입자는 엑소 좀 이전에 관찰 된 프로파일과 일치한다. 또한, 입자의 캡처 다음 저전압 CSW의 사용은 비드 표면에서 제거화물 릴리스 전통적인 용해 완충액 기반 방법과 동일한 DNA 분해 프로파일을 일으키는 것으로 도시되어있다. 이 데이터는 exosomal화물 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 자원을위한 국가 센터 (FW에) 부여 UL1TR000124을 통해 번역 상 과학, 건강의 국립 연구소를, 전진을위한 국가 센터에 의해 지원되었다; 펠릭스 & 밀드레드 깨갱 기증 교수 및 (DTWW에) 반스 가족 기금 (MT에) 상 수 T90DE022734에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 치과 및 두개 안면 연구소의 국립 연구소. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
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