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Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants त्वचीय घाव भरने में कलेक्टिव सेल प्रवास और Reepithelialization अध्ययन करने के लिए

Published: February 25, 2015 doi: 10.3791/52489
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 1
1Biomedical Sciences Program, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Midwestern University

Summary

Zebrafish keratocytes explants से सेल शीट में विस्थापित और उपकला घाव भरने के संदर्भ में सामूहिक सेल प्रवास के तंत्र के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल प्रदान करते हैं। इन प्रोटोकॉल विस्तार सामूहिक सेल प्रवास assays में उपयोग के लिए प्राथमिक explant संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक कारगर तरीका है।

Abstract

कारण उनके अद्वितीय गतिशील गुणों के लिए, मछली keratocytes explant संस्कृतियों लंबे एकल सेल प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है से अलग। गतिशीलता का तेजी से दरें, एक सीधा actin के केबल के साथ व्यापक actin के अमीर lamellae, और अपेक्षाकृत स्थिर गति और: explants स्थापित कर रहे हैं हालांकि, जब इन कोशिकाओं को भी अलग-अलग प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल keratocytes बनाने के लिए जो सुविधाओं के कई बनाए रखने, सामूहिक रूप से ले जाने के प्रवास की दिशा। जल्दी explants में, सामूहिक रूप से पलायन कर उन लोगों के साथ व्यक्तिगत रूप से पलायन कोशिकाओं का तेजी से interconversion प्रवास की विधा का निर्धारण करने में सेल सेल adhesions की भूमिका का अध्ययन करने की अनुमति देता है, और प्रवास के दो मोड के बीच आणविक लिंक पर जोर दिया। Mesenchymal संक्रमण के लिए एक उपकला होता है और घाव भरने और सूजन के साथ जुड़े जीन विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं के रूप में बाद में explants में कोशिकाओं के तेजी से और सामूहिक रूप से विस्थापित करने के लिए अपनी क्षमता खो देते हैं। इस प्रकार, keratocyte explants त्वचीय घाव भरने के दौरान होता है और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का एक परिभाषित कार्यक्रम के संदर्भ में सामूहिक सेल प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी प्रणाली का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि reepithelialization के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं। उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की एक किस्म उपलब्ध हैं, explants के विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ मछली से स्थापित करने के लिए अनुमति देता है। यह इन प्रक्रियाओं के भीतर विभिन्न प्रोटीन की भूमिका विशिष्ट संबोधित करने की अनुमति देता है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल सामूहिक सेल प्रवास से संबंधित assays के एक किस्म में इस्तेमाल के लिए इन explant संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक आसान और प्रभावी विधि का वर्णन।

Introduction

सेल गतिशीलता का अध्ययन परंपरागत रूप से व्यक्तिगत रूप से पलायन कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है। मछली और उभयचर explants से सुसंस्कृत Keratocytes 1-6 दृष्टिकोण प्रयोगात्मक और गणितीय दोनों मॉडलिंग का उपयोग करते हुए सेल गतिशीलता के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली साबित किया है। एक समान आकार, गति और दिशा को बनाए रखते हुए व्यक्तिगत रूप से पलायन कोशिकाओं पर प्रयोगात्मक कार्य, कोशिकाओं का तेजी से, चिकनी ग्लाइडिंग गति से सहायता प्राप्त है। विशेष रूप से embryogenesis, घाव भरने, और मेटास्टेसिस के दौरान, सेल सेल जंक्शनों को बनाए रखते हुए हालांकि, विवो में, कोशिकाओं अक्सर सामूहिक रूप से चलते हैं। इस प्रकार, सामूहिक सेल प्रवास सेल प्रवास के क्षेत्र के भीतर अनुसंधान के एक बढ़ रहा है और तेजी से प्रमुख क्षेत्र है। इन कोशिकाओं के सामूहिक प्रवास हाल ही में 7 वर्णित किया गया है और यह एक घाव भरने मॉडल में सामूहिक सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली बनाने के लिए जो कई अद्वितीय विशेषताएं है।

ove_content "> तराजू एक anesthetized वयस्क zebrafish से plucked रहे हैं, कुछ उपकला ऊतक पैमाने के नीचे करने के लिए जुड़ा रहता है। सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जाता है, इन उपकला कोशिकाओं, या keratocytes, पैमाने से एक सामूहिक इकाई के रूप में तेजी से पलायन। explant संस्कृति कोशिकाओं वे एक अक्षुण्ण उपकला पैर जमाने के लिए बिस्तर एक घाव की अनंतिम मैट्रिक्स भर के रूप में होगा explant से दूर विस्थापित जिसमें एक उपकला घाव भरने मॉडल, के रूप में देखा जा सकता है। हाल ही के डेटा से पता चलता है कि इस पूर्व vivo संस्कृति mimics की कई विशेषताएं है कि vivo में वयस्क zebrafish में चिकित्सा घाव। घाव बंद दरों में आठ पूर्व vivo प्रणाली 7 में मनाया समान माइग्रेशन गति के लिए अनुवाद करते हैं। इसके अलावा, एक Vivo में घाव में मॉडल चिकित्सा, वारफ़रिन के साथ इलाज के रक्तस्तम्भन दर पर कोई प्रभाव नहीं है कि पता चलता है hydrocortisone के साथ इलाज के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने के लिए है, जबकि चिकित्सा की, reepithelialization 8 देरी नहीं करता

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कई जैविक assays में उपयोग के लिए स्थिरता और reproducibility सुनिश्चित है कि zebrafish keratocyte explant संस्कृतियों स्थापित करने के लिए कैसे करें। ये explant संस्कृतियों कई कारणों के लिए सामूहिक सेल प्रवास के लिए इन विट्रो मॉडल में एक विशेष रूप से मजबूर कर रहे हैं। सबसे पहले, zebrafish keratocytes explant संस्कृतियों की स्थापना के घंटे के भीतर इस्तेमाल किया प्राथमिक कोशिकाओं रहे हैं। इसलिए, इन कोशिकाओं प्राथमिक कोशिकाओं 9-13 के पारित होने के साथ जुड़े रूपात्मक और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं आया है। दूसरा, इस प्रणाली लोग घायल हो गए के जवाब, mesenchymal tr के लिए एक उपकला के हिस्से के रूप में, 14 लोग घायल हो गए के जवाब में reepithelialization के अध्ययन के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है औरजीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और cytoskeletal rearrangements 14,15 इसका सबूत के रूप ansition (EMT) की प्रक्रिया शुरू की है। इस प्रकार, अनुपचारित कोशिकाओं में पाए जाते हैं, जो जीन अभिव्यक्ति और गतिशीलता में पृष्ठभूमि में परिवर्तन की विशेषता और उपचार के साथ परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए एक संदर्भ प्रदान किया गया है। इसके अलावा, मछली keratocyte और मानव keratinocyte कार्यात्मक समकक्ष हैं; दोनों अपने-अपने प्रजातियों के प्राथमिक उपकला कोशिकाओं रहे हैं और उपकला घाव भरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। तीसरा, वयस्क zebrafish मेलेनोमा और अन्य कैंसर 19-21, 8,14 और ऊतक पुनर्जनन 22-24 चिकित्सा त्वचीय घाव सहित मानव रोगों 16-18 की एक किस्म के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मान्यता प्राप्त कर रहे हैं।

इस मॉडल प्रणाली की तकनीकी फायदे समान रूप से बाध्यकारी हैं। उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक लाइनों की बढ़ती संख्या गैर लाभ, केंद्रीकृत सुविधाओं से उपलब्ध हैं। विशेष रूप से, zebrafish म्यूटेशन परियोजना (ZMP) वेलकम ट्रस्ट सेंगर इंस्टीट्यूट में zebrafish जीनोम में जीन कोडिंग हर प्रोटीन में एक पीटा एलील बनाने के लिए करना है। वर्तमान में, वे विशेषता 24,088 alleles के साथ, 11,892 जीन, जीनोम का लगभग 45% उत्परिवर्तित। इसके अलावा, ZMP प्रस्तावों को स्वीकार करता है और नि: शुल्क दस्तक बहिष्कार उत्पन्न होगा। लार्वा और वयस्क zebrafish 25-28 में जीन पछाड़ना में हाल के तरीकों ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण समस्याग्रस्त या अव्यावहारिक है, जिसके लिए विकासात्मक महत्वपूर्ण जीनों के समारोह का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करते हैं।

~ 145 माइक्रोन / घंटा की गतिशीलता की उनकी बहुत तेजी दरों की वजह से शीघ्र ही संस्कृतियों 29 की स्थापना के बाद, assays के (आमतौर पर 24 घंटे या उससे कम समय में) तेजी से पूरा किया जा सकता है। प्रयोगों तेजी से पूरा किया और संस्कृतियों, आरटी पर अच्छी तरह से वीडियो माइक्रोस्कोपी शामिल स्तनधारी सेल प्रवास assays के परहेज कर रहे हैं के साथ जुड़े तकनीकी बाधाओं के कई बढ़ने जा सकता है। इसके अलावा, अनुसंधान बजट कस साल की उम्र में, zebrafish आसानी से और सस्ते में रखा जाता है।

explant के संरचना और व्यवहार जटिल है। पैमाने हटा दिया जाता है जब मछली खून बहाना नहीं है, यह सतही एपिडर्मल परतों की तुलना में बहुत अधिक पैमाने के साथ हटा रहे हैं कि संभावना नहीं है। कोशिकाओं के विशाल बहुमत के लिए एक विरोधी ई cadherin एंटीबॉडी 14 के साथ दाग दिखाई देते हैं के रूप में तराजू शुरू में मछली से हटा रहे हैं जब Keratocytes explant में प्रमुख सेल प्रकार दिखाई देते हैं। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस 14 से vimentin धुंधला की अनुपस्थिति से न्याय के रूप में प्रारंभिक संस्कृति में fibroblasts की कोई सबूत नहीं है। हालांकि, दोहराया पैमाने हटाने के साथ, explant में कई न्यूट्रोफिल होने के लिए वहाँ दिखाई देते हैं (1 वीडियो देखें)। LPS उजागर करने के लिए जब हम उनके आकार, तेजी से गतिशीलता, और सेल चादर के बाहर उनके प्रवास के रूपात्मक टिप्पणियों पर आधारित न्यूट्रोफिल के रूप में इन कोशिकाओं की पहचान की है (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं चमकते बुद्धि दागन्युट्रोफिल साइटोसोलिक कारक के रूप में अच्छी तरह से वे अपनी सतह पर प्रचुर मात्रा में FcRs इंगित करता है कि जो माध्यमिक आईजीजी की एक किस्म के लिए एक एंटीबॉडी (नहीं दिखाया डेटा) एच। कई सेल परतों explant के भीतर मौजूद हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी से ऊपर, नीचे, और सेल keratocyte चादर के बीच दिखाई दे न्यूट्रोफिल के साथ पैमाने पास keratocytes के दो से अधिक परतों के लिए अग्रणी किनारे के पास एक परत की उपस्थिति का पता चलता है।

जल्दी समय बिंदुओं पर, ~ 145 माइक्रोन / घंटा की प्रारंभिक दरों पर explant से keratocytes के सामूहिक प्रवास की शुरुआत बहु परत explant फूट डालना के किनारे, पर कोशिकाओं। explant द्वारा कवर क्षेत्र में तेजी से बढ़ जाती है, चादर के भीतर, तनाव प्रसार सेल करने के लिए अग्रणी है, और अग्रणी धार के अग्रिम की एक कम दर है। नेता और अनुयायी कोशिकाओं के बीच रैपिड interconversions चादर 7 भीतर अनायास गठन छेद के गठन और बंद के दौरान अग्रणी धार पर मनाया जाता है। जैसाExplant के साथ शुरू की EMT प्रक्रिया चादर के टुकड़े और keratocytes उनके विशेष, तेजी से गतिशीलता खो, जारी है। जीन की अभिव्यक्ति और EMT के साथ संगत morphological परिवर्तन, घाव भरने, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं explants के लगभग 10 दिनों में 14 के लिए व्यवहार्य माना जा रहा है के साथ संस्कृति के 7 दिनों के भीतर होते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए AVMA पशु कल्याण सिद्धांतों के अनुरूप है और मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

संज्ञाहरण, उपकरण, और मीडिया के 1. तैयारी

  1. एक वाणिज्यिक dechlorinating एजेंट (पालतू दुकानों पर उपलब्ध है) या 24 घंटे के लिए पानी स्टैंड की अनुमति से उपयोग कर या तो नल के पानी का लगभग 1.5 एल Dechlorinate। तीन 1 एल बीकर प्राप्त करें और पानी dechlorinated 500 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक भरें। किसी भी प्रक्रिया से पहले मछली पकड़ के लिए एक और वसूली के लिए एक लेबल। तीसरे बीकर, tricaine methanesulfonate के 100 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर जोड़ने; इस मछली anesthetized जाएगा जिसमें बीकर हो जाता है।
  2. संस्कृति के माध्यम गर्म, बर्फ के साथ एक उथले ट्रे भरें (RPMI 1640, 10% FBS के (भ्रूण गोजातीय सीरम), 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / gentamycin, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन, 25 मिमी HEPES) आर टी करने के लिए, और स्वच्छ जौहरी चिमटी इकट्ठा होते हैं। इम्मेर से स्वच्छ चिमटी70% इथेनॉल में सुझावों का गाना और इथेनॉल को जलाने के लिए अनुमति देता है, एक लेम्प बर्नर के माध्यम से गुजरती हैं।
  3. 10x बढ़ाई, या माइक्रोस्कोप (व्यक्तिगत पसंद पर पूरी तरह से निर्भर) विदारक - प्रक्रिया 2 के साथ एक वाणिज्यिक, टेबल टॉप रोशन आवर्धक कांच के साथ, बढ़ाई बिना प्रदर्शन किया जाएगा यदि फैसला।

2. explant संस्कृतियों की स्थापना

  1. एक जोत बीकर में मछली और जगह की वांछित संख्या पकड़ो। संज्ञाहरण बीकर के लिए एक एकल मछली स्थानांतरण; यह व्यक्तिगत रूप से मछली anesthetize करने के लिए सबसे अच्छा है।
  2. मछली की तैराकी और गिल आंदोलन को देख कर संज्ञाहरण के प्रभाव की निगरानी। संज्ञाहरण की प्रगति, गिल आंदोलन धीमा कर देती है और मछली अनिश्चित और अक्सर उल्टा तैर जाएगा; के रूप में जल्द ही गिल आंदोलन रहता है के रूप में anesthetized मछली पर विचार करें। इस मछली की मौत में परिणाम हो सकता है के रूप में संज्ञाहरण स्नान में लंबी अवधि के लिए मछली मत छोड़ो।
  3. संज्ञाहरण बीकर और हस्तांतरण से मछली को दूरबर्फ के लिए, चिमटी पकड़े हाथ का सामना करना पड़ पूंछ के साथ क्षैतिज मछली रखकर। तकनीक के साथ और अगर अनुभवी तो कई मछली, explants बनाने के इस समय संज्ञाहरण बीकर में अगले मछली रखने पर विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं।
  4. तराजू निकालने के लिए, स्थिति चिमटी पैमाने के किनारे पर टिप के साथ मछली के समानांतर। पैमाने मछली के शरीर से तरक्की करने के लिए प्रेरित करने के लिए थोड़ा मछली के पक्ष में चिमटी के फ्लैट की ओर दबाना। टिशू कल्चर पकवान में चिमटी, बांधना, और (उलटा) के बिना जगह के साथ पैमाने समझ। गिल क्षेत्र, पार्श्व रेखा, और पंख से परहेज (प्रत्येक पक्ष से 6) एक बड़े वयस्क से 12 तराजू के एक अधिकतम हटाने, प्रक्रिया को दोहराएं।
  5. वसूली बीकर में मछली प्लेस और यह संज्ञाहरण के प्रभाव से ठीक सुनिश्चित करने के लिए निगरानी। इस समय, मछली एक व्यक्ति की टंकी के लिए वापस स्थानांतरित किया जा सकता है। मछली पूर्ण पैमाने उत्थान के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 21 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें।
  6. इस पर निर्भर करते हुएगिलास नीचे पकवान प्रति 6 तराजू - प्रयोगात्मक डिजाइन, प्लास्टिक 35 मिमी टिशू कल्चर इलाज पकवान प्रति 20 तराजू या 4 अप करने के लिए जगह है। तराजू पकवान से तराजू अलग करने के लिए नहीं के रूप में तो धीरे मीडिया जोड़ने से पहले पकवान का पालन करने की अनुमति दें।
    नोट: मीडिया पहला पकवान में जोड़ा जाता है पहले अनुभव के साथ, कई मछली संसाधित किया जा सकता है।
  7. प्रत्येक 35 मिमी डिश में पूरा मीडिया (ऊपर 1.2 देखें) के 1.2 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. अधिमानतः के साथ या अतिरिक्त उपचार के बिना समय के वांछित अवधि के लिए 5% सीओ 2 में 28 डिग्री सेल्सियस पर explant संस्कृतियों सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक गर्म खुर्दबीन मंच पर या वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए एक जीवित सेल संस्कृति कक्ष के भीतर संस्कृतियों सेते हैं।

3. brightfield और वीडियो माइक्रोस्कोपी

  1. शुरू में खुर्दबीन मंच पर सेल पत्रक युक्त और स्थिति के व्यंजन 4X उद्देश्य लेंस का उपयोग ध्यान दें।
    नोट: उच्च magnifications प्रयोग पर निर्भर करता है, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के स्थान चिह्नितप्रत्येक कोशिका चादर और / या मंच पर पकवान के उन्मुखीकरण लगभग एक ही ओरिएंटेशन में पत्रक के साथ समय पर छवियों को लेने की सुविधा होगी।
  2. प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अनुसार, विभिन्न समय बिंदुओं पर इनक्यूबेटर और तस्वीर से बर्तन निकालें और केवल अभी भी छवियों प्रायोगिक समय सीमा से अधिक की जरूरत है अगर इनक्यूबेटर में वापस जगह है।
  3. वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन, निम्नलिखित पर ध्यान देना:
    1. पलायन सेल चादर वीडियो की अवधि के लिए देखने के क्षेत्र में रहता है कि इस तरह के दृश्य के क्षेत्र के भीतर पैमाने / उभरते सेल चादर स्थिति।
      नोट: यह कोशिकाओं पैमाने के नीचे से विस्थापित कैसे देख में कुछ अनुभव ले सकते हैं। लघु वीडियो के लिए, यह लंबे समय तक वीडियो के लिए की तुलना में एक चिंता का कम है।
    2. कम समय फ्रेम के लिए, आरटी पर सेते हैं। अब समय फ्रेम (18 + मानव संसाधन) के लिए, एक गर्म मंच या तापमान बनाए रखने के लिए एक ऊष्मायन कक्ष, पीएच संतुलन का उपयोग करें, और संस्कृति एम के वाष्पीकरण कम करने के लिएedium।

Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए 4. फिक्सेशन

  1. तैयार है और 28 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म सभी समाधान। प्रतिदीप्ति के तहत keratocytes देखने के गिलास नीचे 35 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन का उपयोग कर ऊपर वर्णित के रूप में explant संस्कृतियों विकसित करने के लिए आदेश में। वैकल्पिक रूप से, कांच चैम्बर स्लाइड्स का उपयोग करें।
  2. प्रत्येक पकवान 1.1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde के 0.8 मिलीलीटर जोड़ें। पहला संस्कृति मीडिया को दूर मत करो। 5 मिनट तो समाधान निकालने के लिए महाप्राण के लिए आरटी पर सेते हैं।
  3. प्रत्येक पकवान 1.1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde के 0.8 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट तो समाधान निकालने के लिए महाप्राण के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. 1X पीबीएस में 0.5 मिलीलीटर की 0.2% ट्राइटन X-100 जोड़कर बाहरी ligands या बाहरी epitopes, Permeabilize कोशिकाओं का उपयोग कर जब तक। 5 मिनट तो समाधान निकालने के लिए महाप्राण के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. 1x पीबीएस में 0.5 मिलीलीटर 1% की बीएसए जोड़ें और (4 डिग्री सेल्सियस पर) 1 (आरटी पर) घंटा या हे / N के लिए सेते हैं।
    नोट: प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, पीएचएlloidin इस कदम पर जोड़ा जा सकता है।
  6. ऊष्मायन के बाद, महाप्राण समाधान निकालने के लिए और एंटीबॉडी धुंधला के साथ आगे बढ़ना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह - 3 के लिए 1x पीबीएस में 1% BSA के 2 मिलीलीटर - वैकल्पिक रूप से, कम से कम 1 जोड़कर संस्कृति बर्तन की दुकान।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल

  1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    नोट: निर्माता सिफारिशों उपलब्ध नहीं हैं, (1x पीबीएस में 1% BSA में) प्राथमिक एंटीबॉडी का एक अच्छा प्रारंभिक कमजोर पड़ने 1: पॉलीक्लोनल के लिए 500 और 1: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए 1000; माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए एक अच्छा प्रारंभिक कमजोर पड़ने 1: 1000। संकेत मजबूत है और पृष्ठभूमि में एक समस्या है अगर संकेत कम कमजोर है, अगर उच्च निर्माता से प्राप्त मूल स्टॉक के इन dilutions के समायोजित करें।
  2. 1x पीबीएस समाधान में 1% बीएसए aspirate। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और (4 डिग्री सेल्सियस पर) या हे / एन (आरटी पर) 1 घंटे के लिए सेते हैं। , प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें जगह एक स्वच्छ में और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब लेबल, और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो यह प्राथमिक एंटीबॉडी का पुन: उपयोग के लिए अनुमति देता है।
  3. हटाने और प्रत्येक धोने के बाद पीबीएस discarding, 1x पीबीएस के साथ 5 बार - पकवान 3 धो लें।
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। अगर वांछित, इस कदम के दौरान (किसी भी निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता के बाद) fluorescently लेबल phalloidin जोड़ें। (4 डिग्री सेल्सियस पर) या हे / एन (आरटी पर) 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: इस्तेमाल की phalloidin fluorescently लेबल एक्टिन तंतु के दृश्य के लिए अनुमति देता है; हम 488 लेबल phalloidin हमारे zebrafish keratocytes में सबसे अच्छा काम करता है कि मिल गया है, लेकिन अन्य fluorophores के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें।
  6. हटाने और प्रत्येक धोने के बाद पीबीएस discarding, 1x पीबीएस के साथ 5 बार - पकवान 3 धो लें।
    नोट: डिश 4 डिग्री सेल्सियस होड़ करने में असमर्थ अगर, प्रकाश से कवर किया, संग्रहित किया जा सकता हैतुरंत डब्ल्यू; यकीन 1x पीबीएस कोशिकाओं लेकिन गर्म आरटी के लिए बाहर सूखी नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए भंडारण से पहले डिश में जोड़ा जाता है बनाने के लिए (20 - 30 मिनट), तो बस से पहले अगले कदम के लिए आगे बढ़ने के लिए पीबीएस को हटा दें।
  7. डिश में, प्रयोगात्मक जरूरतों पर निर्भर करता है, के साथ या DAPI के बिना, एक बढ़ते मध्यम के 3 बूँदें और आरटी पर 10 मिनट के लिए बैठते हैं - तैयार निरीक्षण करने के लिए करते हैं, तो 2 जोड़ें।
    नोट: हम DAPI के साथ एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है, ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते मध्यम उपयोग करें, लेकिन अन्य बढ़ते मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है। डिश में बैठने के लिए बढ़ते मध्यम के लिए 10 मिनट की अनुमति दे पकवान के नीचे से गिलास coverslip के आसान हटाने की सुविधा।
  8. ऊष्मायन के बाद, धीरे ढीला और coverslip दूर करने के लिए पकवान के पक्षों पर निचोड़। स्लाइड पर, नीचे, कोशिकाओं को एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते मीडिया के एक अतिरिक्त बूंद जोड़ें और coverslip जगह है।
    नोट: - 2 दिन स्लाइड अब से 1 के लिए रखा जाना चाहिए अगर स्पष्ट नख पॉलिश का उपयोग स्लाइड coverslip के सील पर विचार करें।
  9. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे स्लाइड को ध्यान से देखें।
    नोट: हमारी छवियों का सबसे अधिक तेल विसर्जन के तहत एक 40x या 63X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर लिया गया है, लेकिन विशिष्ट उद्देश्य लेंस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया।

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Representative Results

चित्रा 1 में सचित्र के रूप में, keratocytes की चादरों explant संस्कृति की स्थापना के घंटे के भीतर पैमाने के नीचे से बाहर पलायन कर देखा जा सकता है। कभी-कभी, सामूहिक रूप से पलायन चादर से दूर तोड़ दिया है जो एक व्यक्तिगत पलायन keratocyte मनाया जा सकता है। Explant पहले से plucked किया गया था, जो एक मछली से स्थापित किया गया था के रूप में इसके अलावा, चादर के माध्यम से पलायन प्रचुर मात्रा में न्यूट्रोफिल कर रहे हैं। अब संस्कृति अवधि में, कोशिकाओं के रूप में keratocyte चादर टुकड़े EMT के 14 से गुजरना।

चादर उन्नति की प्रारंभिक दर बहुत तेजी से होता है लेकिन इस दर जल्दी संस्कृति के पहले 48 घंटा (2A चित्रा-सी) के दौरान (~ 3.1 क्रमशः गुना ~ 1.8 बढ़ाने के जो क्षेत्र और internuclear दूरी से मापा और) कोशिकाओं का प्रसार के रूप में धीमा कर देती है। तेजी से वृद्धि सेल प्रसार के साथ जुड़ा नहीं है; (फ्लोरोसेंट thymidine अनुरूप ethynyl deoxyuridine के साथ 24 घंटे के लिए लेबलिंग के बादEdu), ~ कोशिकाओं का 10% कोशिका विभाजन के सबूत दिखाने के लिए, एक दर तब्दील सेल लाइनों में देखा है, लेकिन मानव organotypic संस्कृतियों 30 में reepithelization में शामिल कोशिकाओं के साथ और अधिक सुसंगत की तुलना में कहीं कम है। बाद में समय में, अग्रणी धार के अग्रिम कठिन बना देता है जो चादर के टुकड़े (यह प्रणाली 14 में मनाया EMT के साथ जुड़े एक घटना) को मापने के लिए।

24 घंटे के बाद चादरें द्वारा कवर क्षेत्र, सामूहिक सेल प्रवास 15,31 को बदलने के लिए यौगिकों की क्षमता के लिए एक तेजी से स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उपचार explants स्थापित कर रहे हैं समय में जोड़ा जाता है, चादर क्षेत्र में एक खुराक-प्रतिक्रिया देखा जा सकता है। कुछ स्तनधारी साइटोकिन्स (जैसे, TGF-1 15), (जैसे CXCL12 के रूप में) chemokines और छोटे अणु inhibitors के मूल स्तनधारी प्रणालियों में विशेषता (जैसे, एमएमपी 2, -9, और -13 अवरोधकों 31) को सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। हालांकि, 24 घंटा पर चादर क्षेत्रों में सामान्य रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं ( (चित्रा -3 सी में UEB और Leb) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

कई मामलों में, सामूहिक प्रवास पर उपचार (एस) के प्रभाव को समय की छोटी अवधि में मनाया जाता है। इन मामलों में, वीडियो माइक्रोस्कोपी इलाज के लिए सामूहिक रूप से पलायन चादर की प्रतिक्रिया परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। घुलनशील RGD युक्त पेप्टाइड संस्कृति के माध्यम से (चित्रा 4 में तीसरे पैनल) को जोड़ा गया है, जब एक को बाधित करने के लिएdhesion गठन, चादर के अग्रणी धार पर lamellae तेजी से हटना और चादर detaches और पलटा के बाद में अग्रणी धार। पूरे चादर कम से कम 2 मिनट में retracts के रूप में, इलाज के लिए चादर की प्रतिक्रिया तेजी से किया जा सकता है।

चित्रा 5 में दिखाया गया के रूप में चादर के भीतर या नेता और अनुयायी कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन का स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए, पूरे चादर, फिक्स्ड और कलंकित किया जा सकता है। सेल पत्रक आसानी से बाधित कर रहे हैं के रूप में की देखभाल निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए। हमारे हाथ में, स्तनधारी प्रोटीन के कार्यात्मक डोमेन के लिए कई पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (विशेष रूप से साइटोसोलिक प्रोटीन के) हमारे लिए zebrafish explants में प्रतिक्रिया पार करने के लिए पाया गया है।

चित्र 1
चित्रा 1. सेल चादरों की सामूहिक माइग्रेशन। Explant संस्कृति में स्थापना के बाद, keratocytes विस्थापितएक सामूहिक इकाई के रूप पैमाने के नीचे से बाहर। (ए) के साथ, संस्कृति में केवल दो घंटे के बाद पैमाने से दूर चले गए हैं कि कोशिकाओं के रिश्तेदार राशि को दिखाता है (इ) प्रत्येक घंटे उसके बाद लिया (3 - क्रमश: 6 घंटा,)। सभी छवियों 100X बढ़ाई पर ले जाया गया। पूरे दृश्य 1 वीडियो में दिखाया गया है; एक फ्रेम 6 घंटा समय अवधि में हर 30 सेकंड में लिया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा कलेक्टिव प्रवासन 2. अभिलक्षण। अग्रणी धार की अग्रिम की प्रारंभिक दर, कई बिंदुओं पर मापा जाता है, तेजी से है, लेकिन संस्कृति में पहले 24 घंटा (ए) के दौरान धीमा। सी का उपयोग कर internuclear दूरी और सेल क्षेत्र के मापनultures 4 में तय की और 24 घंटा और DAPI और संदर्भ के रूप में phalloidin के साथ एक ही समय अवधि के दौरान, दोनों क्षेत्र के रूप में मापा जाता है (प्रत्येक नाभिक के केंद्र से मापा) internuclear दूरी और सेल क्षेत्र बढ़ जाती है (कॉर्टिकल एक्टिन से घिरा संकेत मिलता है कि दाग cytoskeleton है, (बी) और (सी) क्रमशः)। प्रत्येक ग्राफ तीन प्रतियों में तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब (± SEM) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा Rapanan एट अल से संशोधित किया गया है। 7 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा कलेक्टिव प्रवासन 3. परख सेल शीट क्षेत्र का उपयोग। संस्कृति की स्थापना के दौरान संस्कृति के माध्यम से जोड़ा, peptआईडीई जेड PLG-NHOH (व्यापक स्पेक्ट्रम एमएमपी) और छोटे अणु एस.बी.-3CT (MMP2 और 9 विशिष्ट) अवरोधकों संस्कृति में 24 घंटा (ए) के बाद सेल चादर क्षेत्र में कमी। (; अनुपचारित सेल शीट के क्षेत्र में तेजी से (बी) वितरित किया जाता है के रूप में, डेटा पाठ में वर्णित है और नीला (ऊपरी संदर्भ सीमा या URL और कम संदर्भ सीमा या LRL में संकेत के रूप में निर्धारित मंझला की मानक त्रुटि के साथ medians के रूप में प्लॉट किया जाना चाहिए सी))। मंझला और यूआरएल और LRL के बीच अंतर (हल्के हरे रंग में छायांकित) ग्राफ पर त्रुटि सलाखों के आकार का निर्धारण। यह आंकड़ा मैकडॉनल्ड्स एट अल से संशोधित किया गया है। 31 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4घुलनशील RGD पेप्टाइड आर /> चित्रा 4. इसके अलावा pretreatment के दौरान। शीट त्याग करने के लिए होता है और एक RGE युक्त पेप्टाइड के बाद इसके अलावा, सेल चादर अग्रिम जारी है। 15 सेकंड के एक RGD युक्त पेप्टाइड के बाद इसके अलावा, अग्रणी धार (डालता है) पर lamellae में कमी नहीं है। एक अतिरिक्त 30 सेकंड के बाद, चादर, वीडियो की अवधि के दौरान जारी है जो एक त्याग वापस लेना शुरू होता है (कुल वीडियो लंबाई ~ 5 मिनट, 2 वीडियो देखें)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख। प्रकोष्ठों MMP14a (लाल) का उत्प्रेरक डोमेन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ दाग और fluorescently लेबल (488) phalloidin (हरा) और / या DAPI साथ counterstained गया(ब्लू)। (सी) और (डी) एक ठेठ 24 घंटा चादर के एक हिस्से को दिखाने के लिए है, जबकि (ए) और (बी) के पैमाने से उभरती एक ठेठ चार घंटा चादर का प्रतिनिधित्व करते हैं। सभी छवियों 400X बढ़ाई पर ले जाया गया। MMP14a धुंधला की तीव्रता नेता कोशिकाओं (ए) और (ग)) में देखा जाता प्रमुख (बी (में देखा) और (डी)) उभरते सेल पत्रक के किनारे और प्रमुख lamellipodia में अधिक है कि ध्यान दें। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

संस्कृति के माध्यम के अलावा पहले 3 मिनट - keratocyte explant संस्कृति की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम पैमाने लगभग 2 के लिए संस्कृति डिश का पालन करने की अनुमति है। लगभग तराजू के 75% पालन करना और (एक प्रयोग के लिए स्थापित संस्कृतियों की संख्या के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगी) शीट्स बढ़ेगा। Keratocyte चादरें मछली से हटा दिया है और कई कारणों के लिए संस्कृति में रखा हर पैमाने के आसपास फार्म नहीं है। सबसे पहले, explants के DAPI धुंधला कुछ तराजू कुछ कोशिकाओं संलग्न है कि पता चलता है और इस तरह यह इन तराजू keratocytes की चादरों नहीं होगा कि उम्मीद है। दूसरा, टिशू कल्चर पकवान का पालन करने explants की क्षमता चादर माइग्रेशन के लिए एक आवश्यक शर्त है। स्थापित है तराजू पालन करना है कि क्या की एक प्रमुख निर्धारक और एक सफल explant संस्कृति विकास सतह और मीडिया के अलावा पर पैमाने रखने के बीच का समय है। मीडिया के बिना पालन करने के लिए अपर्याप्त समय floatin तराजू को बढ़ावा मिलेगाबहुत लंबे समय से एक अवधि (बिक्री की बढ़त पर दिखाई सेल अवशेष के साथ explant के बाहर सुखाने के लिए संभवतः की वजह से) कोई वृद्धि के साथ पक्षपाती तराजू में परिणाम होगा, जबकि मीडिया में जी (कभी कभी दिखाई ऊतक के साथ संलग्न)। पैमाने डिश में प्लेसमेंट और मध्यम विकास के अलावा बीच के समय में इस तरह के बाहर सुखाने के बिना पकवान का पालन कर सकते कितनी तेजी से कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं प्रयोगशाला कमरे के भीतर का तापमान और आर्द्रता के रूप में कारकों के रूप में, प्रयोगात्मक निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, zebrafish विशिष्ट एंटीबॉडी की संख्या बढ़ती जा रही है हालांकि, उपलब्ध अभिकर्मकों की विविधता को सीमित किया जा सकता है। Immunogen और लक्ष्य प्रोटीन के बीच एक 85% अनुरूपता आम तौर पर पार जेट के लिए आवश्यक माना जाता है। हालांकि, इस तरह सक्रिय साइटों, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों, और संशोधन की साइटों के रूप में के रूप में कार्यात्मक डोमेन प्रोटीन के अन्य क्षेत्रों की तुलना में अधिक संरक्षित कर रहे हैं, इन क्षेत्रों के लिए निर्देशित विरोधी पेप्टाइड पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी अक्सर किया जा सकता हैसमग्र अनुरूपता कम है, भले ही इस्तेमाल किया। कटौती साइटों इसी प्रकार अत्यधिक 31 संरक्षित कर रहे हैं, जबकि उत्प्रेरक और प्रोटीन बाध्यकारी साइटों में 96% - zebrafish MMP14a अपने मानव ortholog साथ एक समग्र 68% पहचान है, हालांकि उदाहरण के लिए, 79 को पहचान बढ़ जाती है के अंश (मूल्य = 0 उम्मीद)। डेटा एक एंटीबॉडी मानव MMP14a की catalytically सक्रिय साइट के लिए निर्देशित सुझाव है कि zebrafish संस्कृतियों keratocytes के साथ पार प्रतिक्रिया करते हैं। zebrafish शीट में धुंधला अग्रणी धार 31 में फैला कोशिकाओं को स्थानीय बनाना हो सकता है कि सुझाव MMP14 एक यांत्रिक सेंसर 32 के रूप में सेवा कर सकते हैं सुझाव है कि अन्य डेटा के साथ संगत है।

यह unsterile Aquaria पानी में एक मछली तैराकी से एक पूरी तरह से बाँझ explant बनाने के लिए संभव नहीं है। हमारे प्रयोगों के सबसे 24 घंटा के भीतर पूरा कर रहे हैं, हम explants के बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण के साथ कोई मुद्दों का अनुभव। हालांकि, अब ऊष्मायन अवधि वांछित हैं जब, को बनाए रखने बाँझपन ओएफ explants एक मुद्दा बन सकता है। ऊष्मायन के तीन या अधिक दिनों से जुड़े एक प्रयोग की योजना बना, कई सावधानियों संस्कृतियों पवित्र रहते हैं कि संभावना बढ़ाने के लिए लिया जाता है। सबसे पहले, जीवाणु भार को कम करने के लिए, मछली ताजे के तीन परिवर्तन के बारे में एक घंटे के लिए तैरने के लिए अनुमति दी है, के साथ या / एमएल केनामाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति के अलावा बिना पानी के नल dechlorinated। दूसरा, मीडिया एंटीबायोटिक की पर्याप्त स्तर को बनाए रखने और वर्तमान में किसी भी बैक्टीरिया की संख्या को कम करने के लिए एक दैनिक आधार पर विमर्श कर रहा है। विशेष रूप से लंबे समय incubations के लिए (> 5 दिन) 1x पीबीएस के साथ तीन washes के प्रत्येक मीडिया आदान प्रदान के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं। बहरहाल, यह इस मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी के रूप में explant संस्कृति एक बहिर्जात परिसर के साथ व्यवहार किया जाता है जब प्रयोगात्मक डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए जो एक चर का परिचय। इसके अलावा, explant द्वारा स्रावित साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों प्रत्येक मीडिया आदान प्रदान के साथ हटा दिया जाएगा। हालांकि, सेल संख्या कम है और मीडिया की मात्रा के रूप मेंएक ठेठ keratocyte explant में बड़ी है, इस आशय पर्याप्त नहीं हो सकता।

मछली तराजू पूरी तरह से 33 पुनर्जीवित करने के लिए तीन सप्ताह की आवश्यकता के रूप में, हम मछली प्रयोगों में मछली के समय से पहले दोहराया उपयोग की इस अवधि के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए सलाह देते हैं। उपकला परत में सुधार और अधिक तेजी से होता है, हम एक ही मछली का उपयोग करने के बीच समय के इस लंबाई इंतज़ार मछली 34 में त्वचीय घाव भरने में सूचित किया गया है जो प्रणालीगत भड़काऊ प्रभाव के लिए मौका कम से कम अनुमान है कि।

Explants लंबे उपकला कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। मछली प्रजातियों और उभयचरों की एक विस्तृत विविधता से explants व्यक्तिगत और सामूहिक सेल प्रवास के स्तर 3-6,35-37 पर समान गतिशील गुण होते हैं। इन कोशिकाओं को स्तनधारी explants से अलग अलग गतिशील गुण होते हैं लेकिन समग्र संरचना और संगठन समानता 8,30,38 के एक उच्च डिग्री है प्रकट 14 संरक्षित किया जाना है।

हम इस प्रोटोकॉल हमें 14 घाव भरने की प्रारंभिक अवस्था मॉडल है कि प्राथमिक सेल explants का उपयोग कर zebrafish keratocytes के सामूहिक प्रवास का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है कि मिल गया है। नव स्थापित प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग कर प्रयोगों का आयोजन धारावाहिक प्राथमिक कोशिकाओं के पारित होने या तब्दील सेल लाइनों के इस्तेमाल से जुड़े मुद्दों से बचा जाता है। Explants संस्कृतियों स्थापित कर रहे हैं जब EMT शुरू की है के रूप में त्वचीय घाव भरने में EMT की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे अध्ययन इन प्राथमिक explants अधिक सही vivo में घायल उपकला परत के भीतर keratocytes के प्राकृतिक व्यवहार और प्रवास की नकल का सुझाव है कि। इस प्रोटोकॉल प्रवास assays में उपयोग के लिए प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए और साथ ही प्रयोगात्मक Condit के एक मालूम होता है अंतहीन सरणी में जीन और / या प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच के लिए आधार प्रदान करता हैआयनों। प्रक्रियाओं, आसान, त्वरित, सस्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और किसी भी शोध संस्थान में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं।

सारांश में, इस explant तकनीक EMT के दौर से गुजर रहा है, जो एक घाव भरने मॉडल के संदर्भ में सामूहिक सेल प्रवास के लिए एक तेजी से परख प्रदान करता है। एक orienting पैमाने के साथ कई परतों में कई प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति इस पूर्व vivo संस्कृति प्रणाली को जटिलता प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के अनुसंधान सुविधा अनुदान EEH और रिसर्च के मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय कार्यालय और अंदर का अनुदान KJL सम्मानित करने के लिए प्रायोजित कार्यक्रमों के लिए सम्मानित किया स्वास्थ्य विज्ञान के मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय कॉलेज से धन के द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) MatTek P35GC-1.5-14-C 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 VWR 21909-460 We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.

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विकास जीवविज्ञान अंक 96 कलेक्टिव सेल प्रवास reepithelization zebrafish keratocyte mesenchymal संक्रमण सेल सेल आसंजन त्वचीय घाव भरने के लिए उपकला
Zebrafish Keratocyte Explants त्वचीय घाव भरने में कलेक्टिव सेल प्रवास और Reepithelialization अध्ययन करने के लिए
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