Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
מימן אמיד / החלפת דאוטריום (ssHDX-MS) ותיוג photolytic צד שרשרת (ssPL-MS) ואחריו ניתוח ספקטרומטריה יכולים להיות בעל ערך לאפיון הניסוחים lyophilized של תרופות חלבון. תיוג ואחרי עיכול מפרקי חלבונים מתאים מאפשר מבנה החלבון והאינטראקציות להיות ממופים עם רזולוציה ברמה-peptide. מאז חלבון אלמנטים מבניים התייצבו על ידי רשת של קשרים כימיים מהראשיות-הרשתות וצד-שרשרות של חומצות אמינו, תיוג ספציפי של אטומים בשאריות חומצת אמינו מספק תובנה המבנה והמבנה של החלבון. בניגוד לשיטות שגרתיות משמשות ללמוד חלבונים במוצקים lyophilized (למשל, FTIR), ssHDX-MS וssPL-MS לספק מידע כמותי וספציפי לאתר. התאגדות דאוטריום ופרמטרים הקינטית המידה יכולה להיות קשורה במהירות ובאיטיות להחלפת בריכות אמיד (מהיר N, N איטי) וישירות משקף את מעלותרי של קיפול חלבונים ומבנה בניסוחי lyophilized. תיוג photolytic יציב אינו עובר בחזרה לבורסה, יתרון על פני ssHDX-MS. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לשני ssHDX-MS וssPL-MS, באמצעות מיוגלובין (Mb) כחלבון מודל בניסוחי lyophilized המכילים גם trehalose או סורביטול.
תרופות חלבון הן המגזר בעל הצמיחה המהירה ביותר של תעשיית הביו-פרמצבטיקה ומציעות טיפולים חדשים ומבטיחים לטיפול במחלות סוררות בעבר, כוללים הפרעות הורמונליות, סרטן ומחלות אוטואימוניות 1. בשינה 2012, שוק biotherapeutics העולמי הגיע 138,000,000,000 $ והוא צפוי להגיע 179,000,000,000 $ על ידי השינה 2018 2. החלבונים הם גדולים יותר ושבירים יותר מתרופות מולקולה קטנה קונבנציונליות ולכן הם רגישים יותר לסוגים רבים של השפלה 3. כדי להבטיח חיי מדף ויציבות נאותים, תרופות חלבון לעתים קרובות כפי שנוסחו lyophilized (כלומר, מיובש בהקפאה) אבקות מוצקות. עם זאת, חלבון, עדיין עשוי לעבור השפלה במצב המוצק, במיוחד אם המבנה המקורי שלו לא נשמר במהלך 4,5 תהליך lyophilization. הבטחת המבנה שנשמר היא אפשרית רק אם יש שיטות אנליטיות שיכולה לחקור קונפורמציה חלבון במצב המוצק עם sufficienהרזולוציה t.
ספקטרוסקופיה NMR 6 וקריסטלוגרפיה רנטגן 7 הן שיטות הרזולוציה גבוהה הנפוצה המשמשות להערכת מבנה חלבון במוצקים גבישיים ופתרון 8. בגלל האופי של חומרים בלתי פעיל ושיטות העיבוד משמשות, ניסוחים חלבון lyophilized הם בדרך כלל אמורפי ולא גבישים 9. חוסר האחידות וסדר מיקרוסקופי הופך את הטכניקות שהוזכרו לעיל מעשיים עבור חלבונים במוצקים אמורפיים. ספקטרוסקופיית פורה (FTIR) 10, ספקטרוסקופיית ראמאן 11 וספקטרוסקופיה אינפרא אדום הקרובה (NIR) 12 היו בשימוש באופן קבוע על ידי תעשיית הביו-פרמצבטיקה להשוות מבנה שניוני באבקות lyophilized לזה של המבנה-פתרון של המדינה האם. עם זאת, שיטות אלה הן ברזולוציה נמוכה, ורק יכולות לספק מידע על שינויים הגלובליים במבנה משני. אפיון מבני של מצב מוצק באמצעות FTIRהראה גם 13,14 החלש או מתאם 15 עני עם יציבות אחסון לטווח ארוך. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות ברזולוציה גבוהה מתאימות לזהות הפרעות מבניות של חלבונים במצב המוצק.
תיוג כימי יחד עם proteolysis וניתוח ספקטרומטריה התפתח גישה רבת עוצמה לניטור מבנה חלבון ואינטראקציות מולקולריות בתמיסה מימית. בפיתוח תרופות, HDX-MS שמש במשך מיפוי epitope באינטראקציות אנטיגן-נוגדן 16,17, כדי למפות אינטראקציות קולט סמים 18, כדי לפקח על ההשפעות של שינויים, שלאחר translational בקונפורמציה של תרופות חלבון 19, וכדי להשוות וריאציה אצווה לתצווה בפיתוח biosimilars 20. באופן דומה, ligands photoactivatable כבר משמש לזיהוי מטרות תרופה ולקבוע זיקה וספציפיות של תגובות בין תרופתי קולט 21,22 מחייבת. לדוארספקטרומטריית Xtend היישום של שיטות אלה לניסוחי lyophilized, הקבוצה שלנו פיתחה מצב מוצק המוני חילופי דאוטריום המימן (ssHDX-MS) וספקטרומטר מסת תיוג photolytic מצב מוצק (ssPL-MS) ללמוד תצורות חלבון ואינטראקציות חומר לא פעילות בדגימות lyophilized עם רזולוציה גבוהה.
בשני ssHDX-MS וssPL-MS, החלבון מתויג תחת תנאי תגובה אידיאליים במוצקים lyophilized, ולאחר מכן הדגימות מחדש ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה עם או בלי עיכול מפרקי חלבונים. ssHDX-MS מספק מידע על חשיפת שרשרת העיקרית לאדי דאוטריום, בעוד ssPL-MS מספק מידע על הסביבה של רשתות בצד (איור 1). שתי שיטות ובכך יכולות לספק מידע משלים לגבי קונפורמציה חלבון במצב המוצק. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כללי ללימוד חלבונים במוצקים lyophilized באמצעות ssHDX-MS וssPL-MS (איור 2), תוך שימוש בMb כחלבון מודל. אנחנו מראים את היכולת של שתי שיטות ללהבחין בהבדלים בניסוחים עם שני חומרים בלתי פעילים שונים.
איור 1:. מבנה חלבון מידת ssHDX וssPL במוצקים lyophilized באמצעות מנגנוני תיוג שונים (א) בHDX, אמיד עמוד השדרה מימנים חליפין עם דאוטריום כפונקציה של מבנה החלבון ו- D 2 O נגישות. במצב המוצק, השיעור ומטבע זר דאוטריום המידה תלויה ברמה של D 2 O וספיחה, ניידות חלבון (התגלגלות וקפל שוב את האירועים) והטבע של החומרים לא הפעילים קיימים במטריצה המוצקה. (ב) בPL, קרינת UV ב365 ננומטר יוזם את הקמתה של קרבן תגובת ביניים מהקבוצה הפונקציונלית diazirine של pLeu והוכנס אינו ספציפי לכל אג"ח XH (x = כל אטום) או, מודעהטוליפ אין על פני אג"ח = C C בסביבתו הקרובה. במצב המוצק, השיעור ושל תיוג המידה תלויה בריכוז המקומי סוכן התיוג של, זמן הקרנה, מבנה חלבון והטבע של חומרים לא פעילים קיימים במטריצה המוצקה. לוחות A ו- B להראות התיוג התיאורטי המרבי שיכול להתרחש על עמוד השדרה וצד-רשתות בהתאמה בחלבון.
איור 2: מצב מוצק מראה סכמטי HDX-MS () וPL-MS (B) לחלבון בניסוח lyophilized.
מספר מחקרים הראו כי הסביבה המקומית בדגימות lyophilized משפיעה פירוק חלבונים 5,29,30. עם זאת, הקמת מערכת יחסים ישירים בין מבנה חלבון ויציבות במצב המוצק לא הייתה אפשרית בשל חוסר שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה. היישום של שיטות קיימות ברזולוציה גבוהה כגון HDX וPL לאבקות lyophilized דורש שינוי של פרוטוקולי פתרון ופרשנות נתונים זהירים. HDX-MS וPL-MS אומצו ברציפות לפקח על תצורות חלבון במצב המוצק. התוצאות שהוצגו כאן ובמקומות אחרים 27,28,31-33 הדגימו את היכולת של שיטות אלה כדי לפקח קונפורמציה חלבון עם רזולוציה גבוהה בסביבה המוצקה. למרות שהשלבים הקריטיים בניתוח הנתונים אינם משתנים מתיוג בפתרון 34-36, שיקולים חשובים בעת התקנה ניסיונית ופרשנות נתונים נדרשים לחמי מצב מוצקתיוג cal.
בחירה של מגיב התיוג חייבת להיות מבוססת על גודל ומנגנון של תיוג. הגודל הקטן של דאוטריום מאפשר את עמוד השדרה פפטיד שחקר בקלות, ואילו הגודל גדול יחסית של pLeu מגביל תיוג לצד הרשתות. שני ssHDX וssPL לא מראים העדפה לכל חומצת אמינו, כך שהתיוג תלוי רק בעמוד השדרה וצד-שרשרת חשיפה למטריצה. לחקור ביעילות תצורות חלבון במצב מוצק, הגורמים החיצוניים המשפיעים על תהליך התיוג חייבים להיות מבוקרים בקפידה. הסכום הכולל ואת הפריסה המרחבית של סוכן תיוג במוצקים lyophilized שונה מתמיסות מימיות.
בssHDX, הסכום של D 2 O במטריצה המוצקה עשוי להשפיע על השיעור של חלבון התגלגלות (או התגלגלות חלקי), מקפלים, וחילופי דאוטריום. זה לא המקרה עם הפתרון HDX, שבמדגם החלבון בדרך כלל מדולל עם נפח מספיק של D 2 O.סינון קפדני של ההשפעות של לחות בשיעור ssHDX יכול ליידע את הבחירה של תנאי RH אידיאליים. כדי לשלוט בקצב ספיחת לחות ולמנוע קריסה של האבקה בניסוחים המכילים חומרים בלתי פעיל hygroscopic (למשל סוכרוז וtrehalose), ssHDX עשויה להתבצע בתנאי קירור (2-8 מעלות צלזיוס). המחקר הקודם שלנו על השפעות לחות הראה גדילת שיעור והיקף של חליפין עם עלייה בתכולת לחות, כצפוי. בחלק גדול מהעבודה שלנו, RH ביניים של 43% ב -5 ° C הוכיח להיות אידיאלי להבחין ניסוחים בזמן סביר 24. התגובה מתבצעת בדרך כלל עד שתגיע לרמה. הדבר מבטיח כי ספיחת הלחות ודיפוזיה לתוך מוצק לא שולטים בקצב HDX. השימוש בגדלי מדגם מוצקים קטנים עם מראש lyophilization נפח של ≤2 מיליליטר גם מסייע להבטיח כי ספיחת אדי D 2 O היא למעשה מלאה בתחילת תקופת החליפין. למרות ssHDX-MS מספקמידע כמותי על קונפורמציה של חלבון במצב מוצק, יש תנאים מסוימים שבם פרשנות של נתונים אינן יכולה להתבסס אך ורק על מחקר ssHDX לבד. זה אפשרי כי ספיגת דאוטריום ירד נצפתה במדגם (בהשוואה לקבוצת ביקורת) יכולה להיות בגלל השימור גבוה יותר של מבנה חלבון או הכמות המשמעותית של אגרגטים חלבון בדגימה. במקרה כזה, פרשנות של נתונים ssHDX דורשת תוצאות משיטות משלימות אחרות. הרחבת שיא בספקטרום המוני deuterated נצפתה במשך כמה ניסוחים Mb 27,28. זה יכול להיות בגלל גורמים שונים כמו הנוכחות של אוכלוסיית חלבון מקופלת באופן חלקי, ההטרוגניות המרחבית במדגם, או הדרגתיים המרחבית בריכוז D 2 O. עם זאת, גורמים אלה לא הבחינו בssHDX-MS וזקוק לחקירה נוספת.
כssPL-MS הוא חדש יחסית בהשוואה לשיטות אחרות, למידה מתמשכת abאת היישומים ואת מגבלותיו נדרש. בssPL, התמונה צולבת-מקשר הוא lyophilized עם החלבון. חוסר הלחות מגביל את הניידות של רכיבים בתוך המטריצה המוצקה, וההרפיה המבנית החלקית שעלולות להתרחש עם ספיחת לחות בssHDX אינה תופעה בssPL. זה מגביל תיוג בssPL לסביבה הקרובה של התמונה צולבת-מקשר. עם זאת, בניגוד לHDX-MS, ניתוח MS / MS של החלבון הנקרא קוולנטית יכול לספק מידע מבני ברמת שאריות. מאז תיוג ssPL הוא קוולנטיים ובלתי הפיך, חזרה בורסה אינה מתרחשת וניתן להכין דגימות וניתחו ללא חשש לאובדן של תווית. כדי להקל על דיפוזיה של סוכן תיוג ולשפר את יעילות תיוג במוצקה-מטריצה, ssPL ניתן לבצע עם הגדלת% RH. ספיגת pLeu גם ניתן לשפר על ידי הגדלת הריכוז של סוכן photoreactive. היחס טוחנת של חלבון לpLeu יכול להיות מגוון לפי צורך. באופן כללי, עודף 100x טוחנת של pLeu לפרוחלבון יבטיח תיוג הולם. עם זאת, ריכוז pLeu גבוה עלול לגרום לאובדן של מבנה שליישונים במטריצה המוצקה. לפיכך, בנוסף לקינטיקה תיוג והרכב ניסוח, בחירה של ריכוז pLeu חייבת גם להיות מבוססת על שמירה על השלמות מבנית של חלבון. כpLeu nonselectively תוויות XH (כאשר X = C, N, O) קבוצה, ייתכן שחומרים בלתי פעיל עם אתרי תיוג דומים יכולים להשפיע על הרמה של תיוג חלבון מאוד. ההתערבות של חומרים בלתי פעילים בזמינות pLeu לתיוג חלבון עדיין לא מאופיינת. זה ידוע שהקרבן שנוצר מהפעלת diazirine לא שאריות ספציפי, אולם מחקר אחד מדווח הטיה כלפי ASP וGlu 36. אמנם זה טוב ללמוד על אינטראקציות שאריות ספציפיות, מידע פפטיד-הרמה הוא גם שימושי וניתן להשתמש בם כדי לעצב חומרים בלתי פעילים לחסום אזורים עם חשיפה גבוהה מטריצה במצב המוצק. ssPL-MS מספק מידע איכותי מפורט, אולםנתונים כמותיים צריכים להשיג ומדדים חזקים צריכים להיות מפותחים כדי לנתח הבדלי ניסוח פני מגוון רחב של מערכות lyophilized.
השימוש בתווית שאריות ספציפיות בשילוב עם ניתוח MS / MS יכול לשפר עוד יותר את הרזולוציה לרמת חומצות אמינו. ריאגנטים תיוג כגון 2,3-butanedione לתייג Arg, נגזרי -hydroxysuccinimide N נגזרי -alkylmaleimide ליס וN לCys יכול לשמש כדי למפות בדיוק אינטראקציות מולקולריות באבקת lyophilized. עם זאת ריאגנטים אלה הם pH תלוי והתגובות לא יכולות להיות מבוקרות היטב כתיוג photolytic במצב מוצק. גישה חלופית היא לשלב התמונה צולבת-מקשר לתוך רצף החלבון עם השימוש בקווי auxotrophic תא, מוטגנזה מכוונת או derivatization שרשרת צד.
מחקרי ssHDX-MS וssPL-MS הקודמים שלנו הראו כי תיוג של חלבון תלוי באופי וכמות חומרים בלתי פעילהמשמש 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS של Mb שיתוף lyophilized עם hydrochloride guanidine (Gdn.HCl) הראה ספיגת דאוטריום גדולה מMb במשותף עם lyophilized נמוך משקל מולקולרי סוכרים 32. במחקר שssPL-MS נפרד, Mb שיתוף lyophilized עם Gdn.HCl הראה הגנה טובה יותר מתיוג photolytic מ Mb עם סוכרוז 33. יתר על כן, מדידות כמותיות מssHDX-MS כבר מתאם גבוה עם היציבות של חלבון במהלך אחסון לטווח ארוך 28. מחקרים אלו מצביעים על כך שssHDX או ssPL של חלבון משקף את היקף ההחזקה מבנית של החלבון באבקת lyophilized. אנו מאמינים כי השמירה על מבנה המשני באבקות lyophilized מספקת סביבה נוחה לתיוג שרשרת צד עם pLeu והגנה של מימן אמיד מחילופי דאוטריום. עם זאת, השוואה מפורטת של התוכן אינפורמטיבי מהשיטות הללו צריכה להתבצע בעתיד. למרות הקמת השירות של ssHDX-MS וssPL-MSככלי מיון ניסוח סופו של דבר יהיה עליו להיות מיושמים על חלבונים רבים, תוצאות מהמחקרים האחרונים שלנו תומכת באימוץ הרחב יותר שלה. עם התפתחות נוספת, שיטות אלו צפויים להיות שימושיים נרחב לאפיון ניסוחים חלבון מצב מוצק בתעשיית הביו-פרמצבטיקה.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |