Биоконъюгации и Radiosynthesis из⁸⁹ Zr-ДФО меченых антител

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

Исключительная близость, специфичность и селективность антител делает их чрезвычайно привлекательными векторы для опухолевых ориентированных ПЭТ радиофармпрепаратов. Из-за их многодневных биологического полураспада антитела должны быть помечены позитронных-излучающих радионуклидов с относительно длинными физической полураспада. Традиционно, позитрон-излучающих изотопов ¹²⁴ (Т _1/2 = 4,18 г), ⁸⁶ Y (т _1/2 = 14,7 ч) и ⁶⁴ Cu (т _1/2 = 12,7 ч) были использованы для обозначения антитела по ПЭТ. Совсем недавно, однако, поле стало свидетелем резкого увеличения использования позитронно-эмиссионной радиоактивный ⁸⁹ Zr в основе антител ПЭТ агентов визуализации. ⁸⁹ Zr является почти идеальным радиоизотопные для ПЭТ с иммуноконъюгатов, так как обладает физической половину -Life (т _1/2 = 78,4 ч), который совместим с в естественных фармакокинетики антител и излучает относительно низкую енRGY позитронно, который производит изображения с высоким разрешением. Кроме того, антитела могут быть непосредственно помечены ⁸⁹ Zr помощью сидерофора, полученных хелатообразующего агента десферриоксамин (ДФО). В этом протоколе, простата-специфический мембранный антиген ориентации J591 антитела будут использованы в качестве модельной системы для иллюстрации (1) биоконъюгации бифункционального хелатообразующего агента ДФО-изотиоцианат с антителом, (2) radiosynthesis и очистки ⁸⁹ Zr- ДФО МАБ radioimmunoconjugate, и (3) естественных ПЭТ в с ⁸⁹ Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate в мышиной модели рака.

Introduction

Из-за их замечательной чувствительностью, близость, и селективности, антитела уже давно считаются перспективными векторы для доставки радиоизотопов для раковых клеток. Тем не менее, их применение в позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) была затруднена из-за отсутствия подходящего позитронно-эмиссионной радиоактивного изотопа их маркировки. ^1-3 Один из наиболее важных аспектов при проектировании radioimmunoconjugates является соответствие физического распада наполовину Жизнь радиоизотопа к виво фармакокинетики в антитела. Более конкретно, антитела часто имеют относительно длинные, многодневные биологический период полураспада и, следовательно, должны быть помечены радиоактивными изотопами с сопоставимыми физическими полураспада. Для приложений, ПЭТ, антитела традиционно радиоактивным ⁶⁴ Cu (T _1/2 = 12,7 ч), ⁸⁶ Y (T _1/2 = 14,7 ч), или ¹²⁴ (Г _1/2 = 4,18 D). ^{4, 5} Однако каждый изЭти изотопы обладает значительными ограничениями, которые препятствуют их пригодности для клинической визуализации. В то время как radioimmunoconjugates с маркировкой ⁸⁶ Y и ⁶⁴ Cu доказали перспективным в доклинических исследованиях, как изотопы обладают физическими полураспада, которые являются слишком коротка, чтобы быть эффективным для визуализации в организме человека. ¹²⁴ Я, напротив, имеет почти идеальную физическую полураспада изображений с антителами, но это дорого и имеет субоптимальные характеристики распада, которые приводят к относительно низким разрешением клинических изображений. Кроме того, ¹²⁴ radioimmunoconjugates I-меченого может быть предметом Дегалогенирование в естественных условиях, процесс, который может привести к снижению опухоли к фону отношения активности. ^6,7

Привод, чтобы найти позитронно-эмиссионной радиоактивного изотопа вытеснить ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y и ¹²⁴ я в radioimmunoconjugates вызвал недавний всплеск исследований по ⁸⁹ Zr-меченых антител. ^8-12 Tон причиной появления ⁸⁹ Zr прост: радиоактивный обладает почти идеальной химические и физические свойства для использования в диагностических ПЭТ radioimmunoconjugates ^{13 89} Zr производится через ⁸⁹ Y (P, N) ⁸⁹ Zr реакции на циклотроне с использованием. коммерчески доступны и 100% естественно обильные ⁸⁹ Y цель. ^14,15 радиоактивный имеет позитронов выход 23%, распадается с периодом полураспада 78,4 ч и излучает позитроны с относительно низкой энергией 395,5 кэВ (рис 1). ^13,16,17 Важно отметить, что ⁸⁹ Zr и излучает высокую энергию, 909 кэВ γ-луча с эффективностью 99%. В то время как это излучение не мешает энергично испускаемых 511 кэВ фотонов, это требует дополнительных рассмотрение в связи с транспортировки, погрузки и дозиметрии. Несмотря на это предостережение, эти характеристики распада, в конечном счете означает, что ⁸⁹ Zr не только имеет более благоприятный часУкороченный жизнь для работы с изображениями с антителами, чем ⁸⁶ Y и ⁶⁴ Cu, но также может производить изображения более высокого разрешения, чем ¹²⁴ I, который испускает позитроны с более высокими энергиями 687 и 975 кэВ, а также числа фотонов с энергиями в 100-150 кэВ на 511 кэВ позитрон-создано фотоны. ¹³ Кроме того, ⁸⁹ Zr также более безопасным в обращении, дешевле в производстве, и в residualizes опухолей более эффективно, чем его аналог радиоактивного йода. ^18,19 Одним из потенциальных ограничений на ⁸⁹ Zr является то, что он не имеет Терапевтический изотополога, например, ⁸⁶ Y (ПЭТ) по сравнению с ⁹⁰ Y (терапия). Это исключает строительство химически идентичных суррогатных средств визуализации, которые могут быть использованы в качестве дозиметрических разведчиков для своих терапевтических аналогов. Это сказало, исследования показывают, что ⁸⁹ Zr-меченые антитела имеют потенциал в качестве изображений суррогатов ⁹⁰ Y- и ¹⁷⁷ Lu-меченых иммуноконъюгатов.^20,21

С химической точки зрения, в качестве металла группы IV, ⁸⁹ Zr существует в виде 4 катиона в водном растворе. Ион ZR ⁴⁺ весьма напряженной, относительно большой (вступает в силу ионный радиус = 0,84 Å), и может быть классифицирован как «жесткого» катиона. Таким образом, он обладает предпочтение лигандов, имеющих до восьми жестких, анионных доноров кислорода. Легко наиболее распространенным хелатор используется в ⁸⁹ Zr-меченых radioimmunoconjugates является десферриоксамин (ДФО), сидерофор происхождения, ациклические хелатор подшипник три гидроксаматные группы. Лиганд стабильно координирует катионы Zr ⁴⁺ быстро и чисто при комнатной температуре в биологически соответствующих значениях рН, и полученную Zr-ДФО комплекс остается стабильным в течение нескольких дней в физиологическом растворе, сыворотке крови, и цельной крови. ²² Вычислительные исследования убедительно свидетельствуют что ДФО образует hexacoordinate комплекс с Zr ^4+, в котором металл центр координируется с тремя NEUTRAL и три анионные доноры кислорода лиганда, а также два экзогенных лигандов воды (Рисунок 2). ^23,24 поведение в естественных условиях radioimmunoconjugates, использующих сопряжения эшафот ⁸⁹ Zr-ДФО в целом был превосходным. Тем не менее, в некоторых случаях, изображений и острые исследования показали, биораспределени повышенные уровни активности в кости мышей, которым вводили ⁸⁹ Zr-меченых антител, данные, которые показывают, что osteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ катион выходит из хелатообразующего агента в естественных условиях, а затем минерализуется в кости. ²⁵ В последнее время ряд исследований в разработке новых ⁸⁹ Zr ⁴⁺ энтеросорбенты, особенно лигандов с восемью кислородные доноры появились в литературе. ^24,26,27 Тем не менее, в настоящее время, ДФО является наиболее широко используется хелатор в ⁸⁹ Zr-меченых radioimmunoconjugates с большим отрывом. Множество различныхСтратегии биоконъюгации были использованы для присоединения к антителам ДФО, в том числе Биоортогональные реакции щелчком, реакцию тиол-реактивного ДФО строит с цистеинов в антителе, и реакцию активированного эфира несущих конструкций с ДФО лизина в антителе. ^{4,28- 30} Легко наиболее распространенная стратегия, однако, было использование изотиоцианатом несущей производной ДФО ДФО-NCS (Рисунок 2). ²² Это коммерчески доступны бифункциональное хелатор решительно и надежно образует устойчивые ковалентные тиомочевины связи с лизинов антитела (фиг.3).

За последние несколько лет, широкий спектр ⁸⁹ Zr-ДФО-меченых radioimmunoconjugates были описаны в литературе. Доклинические исследования были особенно многочисленны, показывая антител, начиная от более известной цетуксимаб, бевацизумаб, и трастузумаб более эзотерических антитела, такие как CD105 таргетирования TRC105 и свободного ПСА таргетирования 5À10. ^30-36 Совсем недавно, небольшое количество ранней фазе клинических испытаний с использованием ⁸⁹ Zr-ДФО меченых антител появились в литературе. В частности, группы в Нидерландах опубликованных исследований, использующих ⁸⁹ Zr-ДФО cmAb U36, ⁸⁹ Zr-ДФО Ibritumomab Tiuxetan и ⁸⁹ Zr-ДФО трастузумаб. ^21,32,37 Кроме того, целый ряд других клинических испытаниях с ⁸⁹ Zr меченные radioimmunoconjugates являются в настоящее время, в том числе исследований здесь, в Memorial Sloan Kettering онкологический центр с использованием ПСМА-таргетинга ⁸⁹ ZR-ДФО J591 для работы с изображениями рака простаты и HER2-таргетинга ⁸⁹ ZR-ДФО трастузумаб для визуализации рака молочной железы. ^{23, 30} Кроме того, в то время как радиоактивно меченные антитела остаются наиболее распространенные ⁸⁹ Zr-меченых радиофармацевтических препаратов, радиоактивного металла также чаще используют с другими векторами, в том числе пептидов, белков и наноматериалов. ^38-43 </sup>

Модульность этого ⁸⁹ Zr-ДФО методологии маркировка огромным активом. Репертуар биомаркеров таргетирования антител постоянно расширяется, и интерес в выполнении в естественных условиях ПЭТ с использованием этих конструкций растет быстрыми темпами. В результате, мы считаем, что развитие более стандартизированной практики и протоколов может принести пользу на поле. Отличные письменные экспериментальный протокол для ДФО NCS сопряжения и ⁸⁹ Zr радиомечения уже были опубликованы Vosjan и др. ²² Мы считаем, что наглядная демонстрация, предусмотренных настоящим работы могли бы еще помочь следователям, новые для этих методов. В протоколе в стороны, простата-специфический мембранный антиген ориентации J591 антитела будут использованы в качестве модельной системы для иллюстрации (1) биоконъюгации бифункционального хелатообразующего агента ДФО-изотиоцианат с антителом, (2) radiosynthesis и очистка ⁸⁹ Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate,и (3) в естественных ПЭТ с ⁸⁹ Zr-ДФО монАТ radioimmunoconjugate в мышиной модели рака. ^23,44,45

Protocol

Все в естественных условиях экспериментов на животных, описанных проводились в соответствии с утвержденным протоколом и под этических принципов в Memorial Sloan Kettering онкологический центр Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC). 1. Сопряжение ДФО-NC…

Representative Results

Первым шагом в этом протоколе сопряжения ДФО-NCS с антителом, как правило, довольно прочными и надежными. Как правило, очищенный, хелатообразующий агент, модифицированный иммуноконъюгат может быть получено с выходом> 90%, и с помощью 3 молярных эквивалентов ДФО-NCS в начальной реакции конъ…

Discussion

В то время как строительство, радиоактивной и визуализация ⁸⁹ Zr-ДФО labled radioimmunoconjugates, как правило, довольно простая процедура, важно, чтобы держать несколько ключевых соображений на каждом этапе процесса. Например, возможно, наиболее вероятной причиной для беспокойства во время соп…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide