Summary
Vi presentiamo un sistema di introduzione del campione goccia discreto per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Si basa su un chip microfluidico economico e getta che genera goccioline altamente monodisperse in una gamma di dimensioni di 40-60 micron a frequenze da 90 a 7.000 Hz.
Abstract
Questo protocollo discute la fabbricazione e l'utilizzo di un basso costo chip microfluidico monouso come sistema di introduzione del campione per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Il chip produce monodisperse goccioline campione acquoso a perfluoroesano (PFH). Dimensioni e frequenza delle goccioline acquose possono essere variate nel range tra 40 e 60 micron e da 90 a 7.000 Hz, rispettivamente. Le goccioline vengono espulsi dal chip con un secondo flusso di PFH e rimangono intatti durante l'espulsione. Un sistema di desolvatazione fuoriserie rimuove il PFH e trasporta le goccioline nelle ICPMS. Qui, segnali molto stabili con una stretta distribuzione di intensità possono essere misurate, mostra la monodispersity delle goccioline. Abbiamo dimostrato che il sistema d'introduzione può essere utilizzata per determinare quantitativamente ferro nei bovini singole cellule rosse del sangue. In futuro, le capacità del dispositivo di introduzione può essere facilmente esteso con l'integrazione di ulteriori moduli microfluidica.
Introduction
Analisi elementare di campioni liquidi da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICPMS) è comunemente eseguita utilizzando nebulizzatori in combinazione con camere di nebulizzazione come sistema di introduzione 1. In questo sistema di introduzione del campione il campione viene spruzzato da un nebulizzatore per generare un aerosol polidispersa. Una camera di nebulizzazione a valle viene usato per filtrare grandi goccioline. Questo metodo è associato con un elevato consumo campione (> 0,3 ml min -1) 2 e un trasporto del campione incompleta. Così, diventa impraticabile per le applicazioni in cui sono disponibili i volumi del campione soltanto microlitro, come in studi biologici, forensi, tossicologici e clinici 3. Per ridurre il consumo di esempio, con dimensioni di ugelli nebulizzatori piccoli stati sviluppati 3. Tuttavia, la dimensione ridotta ugello aumenta il rischio di intasamento quando campioni di fluidi biologici non digerito o soluzioni saline concentrate devono essere analizzati 3.
et al. 4. Gli autori iniettato un liquido in ICPMS sotto forma di microgocce discrete monodisperse, prodotte da una micropompa azionato piezo-elettrico. Anche se questo sistema non ha trovato larga applicazione, ha avviato lo sviluppo del concetto di discreta introduzione goccia in ICPMS. Oggi, azionato elettricamente piezo-sistemi, che possono generare goccioline di dimensione di 30, 50, 70 e 100 micron e con frequenze 100-2,000 Hz erogazione, può essere acquistato. Le goccioline possono essere trasportati in ICPMS con quasi il 100% di efficienza 5. Questi distributori microdroplet sono stati applicati per misurare quantitativamente singole nanoparticelle 5,6 e caratterizzare cellule biologiche singole 7. Un sistema simile basato sulla tecnologia a getto di inchiostro termico 8 è stato testato per l'analisi di campioni biologici 9. Anche se l'Available singoli sistemi di introduzione gocciolina sono molto efficienti, può essere utilizzato per piccoli volumi di campione e sono promettenti per l'analisi delle nanoparticelle e cellule, hanno diverse limitazioni. Per un ugello fisso, la dimensione delle gocce può essere variata leggermente (a meno impostazioni personalizzate vengono utilizzate 10). Variazioni delle proprietà fisiche del liquido (pH, contenuto di sale) possono alterare le caratteristiche delle gocce (dimensioni, velocità di iniezione). Inoltre, questi dispositivi sono piuttosto costosi, inclini a intasamento e sono difficili da pulire.
Un altro metodo per generare goccioline è noto nel campo della gocciolina microfluidica 11. Negli ultimi anni goccia microfluidica ha guadagnato interesse (bio) reazioni chimiche 12-15 e per gli studi di cella singola 16,17. Inoltre, questa tecnica è stata applicata per l'introduzione di campioni in ionizzazione electrospray massa spettrometria 18,19 e per la preparazione dei campioni in matrix-assisted laser desorbimento / ionization spettrometria di massa 20,21.
Recentemente, abbiamo introdotto un sistema basato microfluidica per l'introduzione del campione in ICPMS 22. La componente chiave del nostro sistema introduzione è il liquido assistita goccia espulsione (LADE) chip. Questo chip consiste completamente di poli (dimetilsilossano) (PDMS). Nel primo incrocio canale di flusso messa a fuoco viene utilizzato per generare goccioline monodisperse di una soluzione campione acquoso (Figura 1). A tale scopo il altamente volatile (punto di ebollizione 58-60 ° C 23) e portante immiscibile fase perfluoroesano (PFH) viene utilizzato (Figura 1). Queste proprietà PFH consentono una generazione goccia stabile e la rimozione veloce della fase portante. Le modifiche delle proprietà del influenza liquido campione questo metodo di generazione meno, rispetto ad altri generatori di gocce. La dimensione delle gocce è regolabile in un ampio intervallo variando le portate della fase acquosa e la PFH. In un secondar downstreamy giunzione, più PFH viene aggiunto per aumentare la velocità di flusso ad almeno 1 m sec -1. A questa velocità del liquido può essere espulso dal chip in jet stabile e diritta (Figura 1) senza distruzione gocciolina (Figura 1 riquadro). Questo design a doppia giunzione permette il controllo della stabilità del getto indipendente generazione goccia. Le goccioline vengono trasportati alle ICPMS con un sistema di trasporto personalizzato. Tale sistema comprende un tubo caduta e un desolvator membrana per rimuovere il PFH. I residui secchi delle goccioline acquose vengono successivamente ionizzati nel plasma del ICPMS e un rilevatore misura la massa degli ioni. La parte frontale della piastrina è quello di garantire un collegamento stretto con il sistema di trasporto goccia a botte. L'espulsione del campione acquoso come goccioline PFH è vantaggioso, perché il contatto con l'ugello è evitata. Questo riduce notevolmente il rischio di intasamento dell'ugello, che può essere un problema quando si lavora con sospensioni cellulari o cosoluzioni saline ncentrated. I chip LADE, fabbricati da PDMS litografia soft, sono a buon mercato (costo del materiale di circa $ 2 per chip), monouso e facile da modificare. In combinazione con la fabbricazione che richiede solo una piccola quantità di lavoro manuale ciascun esperimento può essere eseguita con un nuovo chip. Pertanto, una pulizia laboriosa non è necessario e la contaminazione crociata è minimizzato.
Qui, la fabbricazione del chip LADE da litografia morbida e la sua applicazione per ICPMS sono descritti. Esempi di misure con una soluzione acquosa ed una sospensione cellulare vengono presentati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU-8 master Fabrication (Figura 2)
NOTA: Eseguire la fabbricazione dei SU-8 maestri stampi in una camera pulita per prevenire i difetti causati da particelle di polvere. Due cialde sono necessari per la fabbricazione, una schiacciata con le caratteristiche microfluidica e uno senza.
- Preparare gli stampi padrone per il chip microfluidica. Prima applicare uno strato di adesione al wafer di silicio.
- Disidratare un wafer di silicio per 10 minuti a 200 ° C. Raffreddare il wafer fino a RT e caricarlo su di un giro verniciatura e di spin cappotto con SU-8 2002 con il seguente protocollo.
- Dispensare circa 3 ml resistono sul wafer.
- Spin il wafer a 500 rpm per 10 sec per diffondere il resist su tutta wafer.
- Spin il wafer a 2.000 rpm per 30 sec per raggiungere un'altezza resistere di circa 2 micron.
- Rimuovere l'eccesso resistere dal bordo del wafer con un tampone imbevuto di acetone, per evitareattaccare del wafer alla piastra calda nel passaggio successivo. Cuocere il wafer per 60 sec a 95 ° C su una piastra calda.
- Esporre l'intero wafer con luce ultravioletta (80 mJ / cm 2 a 365 nm). Post-cuocere il wafer per 120 secondi a 95 ° C.
- Raffreddare il wafer giù e girare immediatamente cappotto wafer nuovamente utilizzando il seguente protocollo per SU-8 2050:
- Spin il wafer a 100 rpm per 20 sec (dispensare circa 3 ml SU-8 resistere durante questa fase).
- Spin il wafer a 500 rpm per 10 sec per diffondere il resist su tutta wafer.
- Spin il wafer a 3.250 rpm per 30 sec conseguente spessore resistere di circa 40 micron.
- Ancora una volta, rimuovere l'eccesso resistono dal bordo del wafer con un tampone imbevuto di acetone e cuocere morbido wafer su una piastra calda per 180 sec a 65 ° C e 360 sec a 95 ° C.
- Preparare la fotomaschera da sticking ad un vetro soda-calce. Vedi Figura 3 per la progettazione maschera. Utilizzare una maschera allineatore per esporre il resist con luce ultravioletta (160 mJ / cm 2, misurata a 365 nm) attraverso la maschera preparata. Cuocere il wafer esposto nuovamente su una piastra calda per 60 sec a 65 ° C e 360 sec a 95 ° C.
- Dopo il raffreddamento il wafer a RT, immergerlo in una piastra di Petri di vetro riempito di sviluppatore per 5 minuti per sviluppare il resist. Agitare delicatamente la capsula di Petri per rimuovere impressionate SU-8. Sciacquare il wafer con isopropanolo e asciugarlo con una pistola di azoto.
- Controllare il wafer al microscopio. Nel caso in cui non sviluppata resistere resti sulle caratteristiche, sviluppare nuovamente il wafer per pochi minuti, come descritto al punto 1.7.
- Rimuovere qualsiasi solvente residuo da cottura wafer per 2 ore a 200 ° C. Controllare l'altezza delle caratteristiche con un profiler passo. Nel caso l'altezza misurata differisce dal altezza desiderata cominciare questo protoil col nuovo e adattare la velocità di centrifuga al punto 1.1.4.
- Per evitare che si attacchi dei PDMS al wafer silanizzata ponendolo nell'essiccatore insieme con 50 ml di 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane in una piccola capsula di porcellana. Ridurre la pressione nell'essiccatore a 100 mbar e incubare il wafer per 12 ore.
- Per le parti vuote PDMS silanizzata altro wafer di silicio con il metodo del punto 1.10. Per risparmiare tempo silanizzata entrambi wafer contemporaneamente in un unico essiccatore.
2. LADE Chip Fabrication
NOTA: Il chip LADE è fatto di due pezzi PDMS che sono legati insieme da incollaggio 24. La prima parte contiene le caratteristiche microfluidica. L'altra parte è piatta e usato per sigillare i canali. Bonded insieme, formano la forma rotonda necessario interfacciare il chip con il sistema di trasporto gocciolina. Qui, la fabbricazione dile due parti e il loro legame è descritto. Tutte le fasi del processo sono mostrati in Figura 4.
- Preparare 44 g di PDMS miscelando 40 g di prepolimero con 4 g di PDMS agente di indurimento (questo si tradurrà in un massimo di 6 chip). Degassarla PDMS in un essiccatore fino a quando non è bolla liberamente (questo richiederà circa 20 minuti).
- Replica stampaggio delle metà strutturati.
- Inserire il modulo colata sopra il wafer e farlo scattare in posizione utilizzando le strutture di guida intorno al disegno (vedi Figura 5). Salta l'aggancio in posizione per il PDMS dimezzare piatta.
- Versare circa 3 a 4 g di PDMS degassificata sotto forma di colata e posizionarlo per 6 minuti su una piastra calda a 150 ° C. Raffreddare i PDMS curati nella forma di fusione e sollevare con cautela il wafer forma di colata con una spatola.
- Per evitare qualsiasi contaminazione dei canali microfluidici coprire il lato del chip che era precedentemente in contatto with il wafer con nastro adesivo. Tagliare con cautela il nastro lungo il bordo della parte PDMS per rimuovere PDMS eccesso.
- Per realizzare i piatti PDMS metà ripetere i passaggi di cui sopra da 2.2.1 a 2.2.3 con la cialda silanizzata vuoto.
- Peel del nastro e perforare collegamento fluido nella metà strutturati con un perforatore biopsia. Proteggere le strutture con nastro adesivo durante la conservazione.
- Incollare i pezzi PDMS insieme da incollaggio utilizzando i PDMS agente 24 di polimerizzazione.
- Prendete un wafer di silicio non trattato e spin cappotto con PDMS agente indurente per 30 sec a 6.000 giri. Prendere la cialda fuori il verniciatore di spin.
- Rimuovere il nastro dalle metà strutturati e metterli con le strutture rivolti verso il basso sul wafer. Spingere delicatamente sopra le PDMS per rimuovere le bolle d'aria.
- Rimuovere il nastro dalle PDMS vuote metà. Dai dimezzare strutturato dal wafer e allineare manualmente sulla parte superiore del PDMS dimezzare piatta. Premere delicatamente ilsepararsi insieme per eliminare le bolle d'aria e lasciare la cura di chip montato per 24 ore a temperatura ambiente. Non spingere le due parti con la forza come questo può causare i canali al collasso.
- Tagliare la punta del chip lungo la linea dell'indicatore ortogonale al canale ugello con un taglierino per aprire l'ugello di uscita. Utilizzare un dispositivo di allineamento per garantire un taglio dritto, che è necessario per una espulsione di liquido diritta. Ispezionare il chip sotto un microscopio per difetti dei canali microfluidica e particelle di polvere. Mettere un nastro sulle prese per proteggere i trucioli durante la conservazione.
- Collegare una bottiglia Woulff con tubo ad una fonte di azoto secco e per tutti gli ingressi del chip LADE. Cassetta 50 ml di 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane sul fondo della bottiglia Woulff e chiuderla.
- Silanizzare i canali microfluidica svuotando tutti i canali per 20 minuti con il flusso di azoto che trasportano 1 H, 1 H H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane ad una portata di circa 1 ml / sec. I chip sono pronti per esperimenti e possono essere conservati per almeno alcune settimane a temperatura ambiente.
3. Preparazione del sistema di misurazione / Droplet Trasporti
NOTA: costruire l'intero sistema di trasporto gocciolina sopra un tavolo ottica, dato che è necessario costruire una struttura di supporto stabile per l'installazione. Uno schema dell'intero sistema di trasporto gocciolina è illustrato in Figura 6.
- Installare un poli ciclonico personalizzato (metilmetacrilato) (PMMA) adattatore con un 50 centimetri allegate tubo in acciaio inossidabile verticalmente. Collegare l'adattatore a una fonte di elio con un controllore di flusso di massa. Collegare un (ad alta velocità), macchina fotografica e una lampada all'adattatore sui siti opposte per la visualizzazione delle gocce.
- Inserire un riscaldatore a cartuccia nel mezzo del tubo di acciaio e utilizzando poli (cloruro di vinile) (PVC) tubo e un tubo Legrisconnettore per collegare l'estremità del tubo di acciaio con l'ingresso del desolvator membrana.
- Collegare l'uscita del desolvator con un altro tubo in PVC a un adattatore di flusso laminare, che è direttamente collegata all'ingresso ICPMS. Collegare l'adattatore flusso laminare ad una sorgente argon con un controllore di flusso di massa e successivamente utilizzarlo per admix Argon per raggiungere una condizione stabile funzionamento.
- Allineare l'adattatore e il tubo verticale in acciaio con una livella. Se l'allineamento non è preciso, si può portare a notevoli perdite di goccioline. Inserire una spina nel adattatore per evitare che i gas fuoriuscita durante il sistema di tempo di riscaldamento.
- Inizia flussi di gas tutto sopra citate e dispositivi che utilizzano le impostazioni da tabella 1. Lasciare che il sistema per riscaldare per 15 min. Il riscaldatore cartuccia deve 2 ore per stabilizzare la temperatura, accenderlo in anticipo.
- Posizionare le pompe siringa su un rack all'altezza di adattatore dell'elio ciclonica. Mantenere la distanza tra lapompe a siringa e l'adattatore più breve possibile.
4. Misure
NOTA: Il seguente protocollo è scritta in termini generali a causa della varietà di soluzioni e sospensioni che può essere utilizzato. Tuttavia, sospensioni cellulari devono essere diluite a una concentrazione di <1 x 10 7 cellule / ml, quando viene eseguita l'analisi singola cellula, per assicurare che la maggior parte delle goccioline trasportare una sola cella. Per misure con celle posizionare le pompe a siringa con un angolo in modo che l'uscita delle siringhe punto verso il basso e installare il tubo in modo che puntano verso il basso.
- Collegare il tubo per le siringhe. Carico due 5 ml siringhe con perfluoroesano e una siringa da 1 ml con una soluzione campione o sospensione. Rimuovere tutte le bolle intrappolate nelle siringhe e tubi.
- Installare le siringhe in una pompa a siringa e collegarli agli ingressi del chip. Avviare le pompe siringa utilizzando le impostazioni iniziali diTabella 1 (o portate maggiori). Dare i flussi da 3 a 5 minuti per stabilizzare.
- Rimuovere il liquido in eccesso dalla punta del chip con un tessuto. I liquidi dovrebbero ora espellere dal chip in un getto rettilineo. Se una espulsione retta non può essere realizzato strofinando con un tessuto sostituire il chip e ricominciare con questo passo.
- Togliere la spina dalla scheda e inserire con attenzione il chip nella scheda. Lubrificare il chip con FC-40, se necessario. Un chip può essere utilizzato per almeno 2 ore di esperimenti.
- Cambiare la portata ad essere entro le impostazioni di misura consigliate dalla Tabella 1. Portata inferiore del PFH non solo salva PFH ma riduce anche il segnale di fondo, causato da interferenze isobariche.
- Dare sistema 2-5 min per stabilizzare (a seconda delle portate scelte). Ottimizzare le ICPMS per l'intensità del segnale più alto degli analiti di interesse.
- Successivamente regolare i flussi di tutti gli gAses sui regolatori di flusso di massa (vedi i valori consigliati in tabella 1), fino l'intensità massima del segnale degli analiti di interesse si ottiene. Tune il potere plasma e le tensioni lente di focalizzazione (secondo intervalli raccomandate dal produttore) sulle ICPMS nello stesso modo.
- Impostare le ICPMS ad un tempo di permanenza di 10 msec (richiesto le ICPMS molto utilizzati, ma può essere regolata con altri strumenti per garantire un'acquisizione risolta nel tempo). Avviare la registrazione del segnale di un particolare m / z usando il protocollo del produttore.
- Dopo la misurazione, trasferire i dati grezzi al programma di analisi dei dati per la valutazione. Bin i dati, riportati nella conta per 10 msec, con un built-in funzione, e la trama risulta valori centrali bin contro conteggi. Montare ogni picco nell'istogramma distribuzione di frequenza tracciata con una funzione di Gauss. La media e sigma del fit rappresentano l'intensità del segnale medio e la sua deviazione standard, rispettivamente.
- Misurare una soluzione unica o standard di multi-elemento che contiene l'elemento o gli elementi di interesse alle stesse portate come il campione.
- Inserire un chip LADE in una capsula di Petri su un microscopio. Per una migliore qualità dell'immagine utilizzare un chip non-round. Realizzare questo chip come descritto al punto 2, ma con una forma semplice fusione rettangolare al posto di quello a forma parzialmente round.
- Seguire i passaggi da 4.1 a 4.2.1 per avviare la generazione goccia. Impostare le portate per le portate utilizzate nella fase 5.1.
- Registrare le immagini di goccioline acquose con una fotocamera ad alta velocità collegato ad un microscopio (obiettivo 20X). Utilizzare un software di analisi di immagine come la morfometria goccia e software velocimetria da Basu 25 per ottenere il diametro medio goccia dalle registrazioni.
- Utilizzare diametro medio delle gocce per calcolare il volume di goccia, assumendo la goccia è un oggetto sferico.
- Da questo volume e la knpropria concentrazione di un analita nel gocciolina calcolare il numero di atomi corrispondenti. Dividere il numero di ioni misurati per gocciolina per il numero di atomi di ottenere l'efficienza di rivelazione. Utilizzare questa efficienza di rivelazione per calcolare il numero di atomi in un campione sconosciuto.
NOTA: Poiché le variazioni tra singoli chip sono piccole 22, non è necessario ripetere la misura della dimensione delle gocce per ogni circuito integrato o soluzione se le portate rimangono le stesse. Un elenco delle dimensioni delle gocce e le frequenze in base alle portate specifiche è pubblicato da Verboket et al. 22.
- Da questo volume e la knpropria concentrazione di un analita nel gocciolina calcolare il numero di atomi corrispondenti. Dividere il numero di ioni misurati per gocciolina per il numero di atomi di ottenere l'efficienza di rivelazione. Utilizzare questa efficienza di rivelazione per calcolare il numero di atomi in un campione sconosciuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il sistema presentato può essere impiegato per misurare piccoli volumi di soluzioni o sospensioni contenenti cellule o nanoparticelle. Esempi di una misurazione di una soluzione standard e caratterizzazione di singole cellule sono mostrati qui. Altri esempi si possono trovare in Verboket et al. 22.
Tipicamente il segnale di una singola goccia di una soluzione è molto breve evento. Di solito dura per pochi 100 msec 26. Con i ICPMS utilizzati qui (tempo di sosta 10 msec) brevi segnali come questi non possono essere risolti temporalmente. Figura 7a e 7b mostrano la Figura segnali e distribuzione di frequenza istogramma di una soluzione standard di Na. Le goccioline arrivano al plasma con un jitter temporale> 10 msec. Il rilevamento è sincronizzato. Segnali di uno (201 ± 24), due (381 ± 34) o tre (560 ± 45) goccioline vengono rilevati entro un tempo di sosta. Low variazione dell'intensità del segnale suggerisce alta dromonodispersity Plet. Il primo picco tailing è probabilmente il risultato di frammenti di goccioline; la causa di questa frammentazione è ancora sotto inchiesta.
Il metodo di taratura descritto in 5 (utilizzando Fe soluzione standard) è stato testato per la determinazione del contenuto di Fe di globuli rossi singola bovina / vitello (6-7 micron di diametro) sospesi in tampone fosfato (PBS). La sospensione di 1 x 10 7 cellule ml -1 stato usato per assicurare che la maggior parte delle goccioline trasportare una sola cellula. La Figura 8 mostra i segnali di celle come distribuzione di frequenza istogramma. In media ogni cellula contiene 5.3 ± 1.2 x 10 8 atomi di Fe (vedi Verboket et al. 22).
Figura 1. Micrografia di goccia generazione, di accelerazione e di espulsione. In un junct flusso di messa a fuocoion, goccioline acquose monodisperse vengono generati nel flusso di PFH. Ulteriori PFH è aggiunto in un secondo bivio. Successivamente, il flusso di liquido viene espulso dal chip LADE attraverso un ugello. Le frecce indicano la direzione del flusso. Bar Scala è di 500 micron. Inserto: Micrografia di una gocciolina acquosa in un guscio PFH dopo l'espulsione dal chip LADE. Scale bar 100 micron. Adattato su autorizzazione di 22. Copyright 2014 American Society Chemical. Questa cifra è stata modificata con i dati di una ricerca condotta dalla pubblicazione nel laboratorio di PS Dittrich. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema del trattamento SU-8. Prima uno strato di adesione è rivestito. Un wafer di silicio è di spinrivestito con SU-8 del 2002, morbido al forno, inondazione esposta con la luce ultravioletta e post forno. In cima a questo livello sono prodotte le strutture microfluidica. Il wafer è di spin rivestito con SU-8 2050 e morbido al forno. La progettazione delle strutture microfluidici viene trasferito al wafer esponendolo con luce ultravioletta attraverso una fotomaschera. Dopo una cottura post-esposizione, il photoresist è sviluppato e viene eseguito un hardbake. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Struttura della fotomaschera per il chip LADE contenente le seguenti caratteristiche: strutture a) di guida per la casseratura, b) un ingresso per il PFH per l'accelerazione gocciolina, c) un ingresso per PFH per la generazione delle gocce e d) un ingresso per il campione acquoso.e) Linea dell'indicatore per tagliare la punta del chip. Larghezze di canale f) = 40 micron, g) = 20 micron e h) = 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Grafico Processo di fabbricazione di chip LADE. Prima la struttura e le PDMS piatte parti sono fabbricate dalla replica stampaggio. I due pezzi sono legati insieme mediante incollaggio. Infine, la punta del chip viene interrotta ed i canali microfluidici sono silanizzato. Adattato su autorizzazione di 22. Copyright 2014 American Society Chemical. Questo dato è stato modificato dopo la pubblicazione. Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
Figura 5. Disegno tecnico del modulo fusione di alluminio per il chip LADE. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Schema del setup (non in scala). Il sistema è composto da chip LADE, un adattatore ciclonico, un tubo di acciaio riscaldato, un desolvator membrana, e un ICPMS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
PLOAD / 52525 / 52525fig7highres.jpg "/>
Figura 7. (A) Segnali di goccioline realizzati di 1 mg kg -1 soluzione standard Na. (B) Distribuzione di frequenza istogramma di questi segnali. Nei 10 msec abitare segnali di tempo di un (gialla), due (rosso) o tre (blu) goccioline sono stati registrati. Media e deviazione standard dei segnali sono stati determinati da funzioni gaussiane montaggio. Le portate utilizzati sono stati 0,5, 50 e 60 ml min - 1 di campione acquoso, PFH per la generazione delle gocce, e PFH per l'accelerazione delle gocce, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Frequenza distribuzione istogramma di 56 Fe + segnala generated da parte dei globuli rossi. media e deviazione standard dei segnali sono stati determinati montando una funzione gaussiana. Le portate erano utilizzati 2, 80, e 80 microlitri min - 1 di sospensione cellulare, PFH per la generazione delle gocce, e PFH per l'accelerazione gocciolina, rispettivamente.
| Ha velocità di flusso del gas | 0,6-0,8 L min -1 | |
| Riscaldatore a cartuccia | 30 W | |
| Temperatura della membrana Desolvator | 160 ° C | |
| Desolvator portata del gas spazzata | 3-4 L min -1 | |
| Portata di gas Ar | 0.1 L min -1 | |
| Potenza al plasma ICP | 1.300 W | |
| Portata del campione | avviare | 1 ml min -1 |
| misura | 0,3-15 ml min -1 | |
| Portata di generazione goccia PFH | avviare | 60 ml min -1 |
| misura | 35-80 min ml -1 | |
| Portata di PFH accelerazione gocciolina | avviare | 60 ml min -1 |
| misura | 35-80 min ml -1 |
Tabella 1. Impostazioni di avvio e consigliate impostazioni di misura per i ICPMS e le pompe siringa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebbene la fabbricazione dei circuiti integrati è molto affidabile ci sono alcuni punti critici durante la fabbricazione che richiedono una particolare attenzione. Innanzitutto, pulizia durante l'assemblaggio è molto importante per evitare la contaminazione del chip dalla polvere. La polvere può bloccare i canali ed evitare una generazione goccia stabile. In secondo luogo, è particolarmente importante che la punta è tagliato ortogonalmente al canale ugello. L'angolo del taglio influenza fortemente l'angolo di espulsione. Se il liquido viene espulso ad angolo può causare una perdita di goccioline espulse.
Quando si costruisce la configurazione in modo che sia stabile. L'allineamento verticale del tubo metallico e l'adattatore sono importanti. Anche durante le misurazioni ci sono alcuni punti che necessitano di particolare attenzione. L'inserimento del chip all'adattatore deve essere eseguita correttamente. Può accadere che durante l'inserimento del getto viene interrotto e si ferma. Per misurazioni con cellule la posizione e orientazione delle pompe siringa e tubi sono importanti. Il loro corretto posizionamento può ridurre sedimentazione delle cellule nella siringa e il tubo.
Il chip LADE qui presentato ha diversi vantaggi rispetto generatori esistenti goccioline commerciali. Il sistema è più robusto, fornisce una gamma più ampia dimensione delle gocce, che può essere ulteriormente esteso modifica della geometria del canale, ed è monouso. Un dispositivo monouso è di particolare interesse per l'analisi di campioni con un elevato contenuto di sali o residui solidi, come ad esempio nanoparticelle o sospensioni cellulari che possono ostruire piccoli canali e non può sempre essere facilmente lavato fuori. Il trasporto di microgocce singole generati dal LADE nella MS è ancora un fattore limitante nel nostro sistema e deve essere ulteriormente ottimizzata. Il gruppo di trasporto goccia corrente, anche se elimina il vapore PFH, che altrimenti creare spettrale aggiuntivo e le interferenze non spettrali e causare instabilità del plasma, ma still risultato di un elevato jitter temporale di arrivo delle gocce in MS e un trasporto goccia incompleto. Rispetto ai sistemi di introduzione gocciolina disponibili commerciale del sistema di trasporto per questa configurazione richiede ulteriori apparecchiature. L'attuale chip è progettato solo per l'introduzione del campione. Tuttavia, con lievi modifiche del design avanzato introduzione e preparazione dei campioni passi nuvola essere implementato on-chip, ad esempio, la diluizione 27-29, ultra veloce di miscelazione 30, reazioni chimiche 31, la separazione 32-34, o cella di smistamento 35,36. Sotto dispositivi introduzione avanzati si capisce per esempio l'introduzione di campione e standard di goccioline in sequenza o in parallelo con un unico chip. Ciò aumenterebbe la capacità e migliorare l'accuratezza delle analisi quantitativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer 100 mm | Si-Mat (Kaufering, Germany) | ||
| SU-8 2002 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| SU-8 2050 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Acetone | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| MR-developer 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | ||
| Isopropanol | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB111155 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS) | Dow Corning (Michigan, U.S.A.) | 39100000 | |
| Perfluorohexane 99% | Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.) | 281042 | |
| FC-40 | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB103511 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies (Paisley, U.K.) | 10010-015 | |
| Red blood cells in phosphate-buffered saline | Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.) | R400-0100 | |
| Single-element standard solutions Na, Fe | Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.) | ||
| Multielement standard solution | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | IV | |
| Nitric acid | Sub-boiled | ||
| Ultrahigh-purity water | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate HP 160 III BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| Spin modules SM 180 BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| High resolution film photomask | Microlitho (Essex, U.K.) | ||
| Step profiler Dektak XT advanced | Bruker (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate MR 3002 | Heidolph (Schwabach, Germany) | used for replica molding | |
| 1.5 mm biopsy puncher | Miltex (Pennsylvania, U.S.A.) | 33-31AA/33-31A | |
| Spin coater WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell (Pennsylvania, U.S.A.) | used for adhesive bonding | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni (Korbussen, Germany) | ||
| 1 ml syringe | Codan (Lensahn, Germany) | 62.1002 | |
| 5 ml syringe | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | |
| PTFE tubing | PKM SA (Lyss, Switzerland) | PTFE-AWG-TFT20.N | |
| Quadrupole-based ICPMS ELAN6000 | PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Membrane desolvator CETAC6000AT+ | CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.) | only the desolvator unit is used | |
| High speed camera Miro M110 | Vision Research (New Jersey, U.S.A.) | ||
| Data analysis program Origin pro | OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | version 8.6 | |
| Microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | IX71 |
References
- Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Liquid sample introduction in ICP spectrometry: A Practical Guide. , Elsevier. Amsterdam. 10-1016 (2008).
- Sutton, K. L., B'Hymer, C., Caruso, J. A. Ultraviolet absorbance and inductively coupled plasma mass spectrometric detection for capillary electrophoresis - A comparison of detection modes and interface designs. J. Anal. At. Spectrom. 13 (9), 885-891 (1998).
- Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Sample introduction systems for the analysis of liquid microsamples by ICP-AES and ICP-MS. Spectrochim. Acta, Part B. 61 (3), 239-283 (2006).
- Olesik, J. W., Hobbs, S. E. Monodisperse dried microparticulate injector - A new tool for studying fundamental processes in inductively-coupled plasma. Anal. Chem. 66 (20), 3371-3378 (1994).
- Gschwind, S., Hagendorfer, H., Frick, D. A., Günther, D. Mass quantification of nanoparticles by single droplet calibration using inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (12), 5875-5883 (2013).
- Garcia, C. C., Murtazin, A., Groh, S., Horvatic, V., Niemax, K. Characterization of single Au and SiO2 nano- and microparticles by ICP-OES using monodisperse droplets of standard solutions for calibration. J. Anal. At. Spectrom. 25 (5), 645-653 (2010).
- Shigeta, K., et al. Sample introduction of single selenized yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) by micro droplet generation into an ICP-sector field mass spectrometer for label-free detection of trace elements. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 637-645 (2013).
- Orlandini v. Niessen, J. O., Schaper, J. N., Petersen, J. H., Bings, N. H. Development and characterization of a thermal inkjet-based aerosol generator for micro-volume sample introduction in analytical atomic spectrometry. J. Anal. At. Spectrom. 26 (9), 1781-1789 (2011).
- Orlandini v. Niessen, J. O., Petersen, J. H., Schaper, J. N., Bings, N. H. Comparison of novel and conventional calibration techniques for the analysis of urine samples using plasma source mass spectrometry combined with a new dual-drop-on-demand aerosol generator. J. Anal. At. Spectrom. 27 (8), 1234-1244 (2012).
- Shigeta, K., et al. Application of a micro-droplet generator for an ICP-sector field mass spectrometer - optimization and analytical characterization. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 646-656 (2013).
- Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P.
- Zheng, B., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. Formation of arrayed droplets by soft lithography and two-phase fluid flow, and application in protein crystallization. Adv. Mater. 16 (15), 1365-1368 (2004).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Li, L., et al. Nanoliter microfluidic hybrid method for simultaneous screening and optimization validated with crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (51), 19243-19248 (2006).
- Zhang, Q., Liu, X., Liu, D., Gai, H. Ultra-small droplet generation via volatile component evaporation. Lab Chip. 14 (8), 1395-1400 (2014).
- Baret, J. C., Beck, Y., Billas-Massobrio, I., Moras, D., Griffiths, A. D. Quantitative cell-based reporter gene assays using droplet-based microfluidics. Chem. Biol. 17 (5), 528-536 (2010).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Pei, J., Li, Q., Lee, M. S., Valaskovic, G. A., Kennedy, R. T. Analysis of samples stored as individual plugs in a capillary by electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (15), 6558-6561 (2009).
- Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (37), 6832-6835 (2009).
- Küster, S. K., et al. Interfacing droplet microfluidics with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: label-free content analysis of single droplets. Anal. Chem. 85 (3), 1285-1289 (2013).
- Pabst, M., Jefimovs, K., Zenobi, R., Dittrich, P. S. High-Resolution Droplet-Based Fractionation of Nano-LC Separations onto Microarrays for MALDI-MS Analysis. Analytical Chemistry. 86 (10), 4848-4855 (2014).
- Verboket, P. E., Borovinskaya, O., Meyer, N., Günther, D., Dittrich, P. S. A New Microfluidics-Based Droplet Dispenser for ICPMS. Analytical Chemistry. 86 (12), 6012-6018 (2014).
- Ammerman, C. N., You, S. M. Determination of the boiling enhancement mechanism caused by surfactant addition to water. J. Heat Transfer. 118 (2), 429-435 (1996).
- Samel, B., Chowdhury, M. K., Stemme, G. The fabrication of microfluidic structures by means of full-wafer adhesive bonding using a poly(dimethylsiloxane) catalyst. J Micromech Microeng. 17 (8), 1710-1714 (2007).
- Basu, A. S. Droplet morphometry and velocimetry (DMV): a video processing software for time-resolved, label-free tracking of droplet parameters. Lab Chip. 13 (10), 1892-1901 (2013).
- Dziewatkoski, M. P., Daniels, L. B., Olesik, J. W. Time-resolved inductively coupled plasma mass spectrometry measurements with individual, monodisperse drop sample introduction. Anal. Chem. 68 (7), 1101-1109 (1996).
- Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (45), 19163-19166 (2010).
- Bremond, N., Thiam, A. R., Bibette, J. Decompressing emulsion droplets favors coalescence. Phys. Rev. Lett. 100 (2), 024501 (2008).
- Niu, X., Gulati, S., Edel, J. B., deMello, A. J. Pillar-induced droplet merging in microfluidic circuits. Lab Chip. 8 (11), 1837-1841 (2008).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125 (47), 14613-14619 (2003).
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Lombardi, D., Dittrich, P. S. Droplet microfluidics with magnetic beads: a new tool to investigate drug-protein interactions. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 347-352 (2011).
- Edgar, J. S., et al. Compartmentalization of chemically separated components into droplets. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (15), 2719-2722 (2009).
- Edgar, J. S., et al. Capillary electrophoresis separation in the presence of an immiscible boundary for droplet analysis. Anal. Chem. 78 (19), 6948-6954 (2006).
- Baret, J. C., et al. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity. Lab Chip. 9 (13), 1850-1858 (2009).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
