Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
Aktuelle Monolage oder Suspensionszellkultur-Assays für die Arzneimittelentwicklung, versäumen es, den menschlichen zellulären Mikroumgebung zu emulieren und damit zu einem raschen Entdifferenzierung und Funktionsverlust in primären humanen Zellkulturen. Gewebemodelle mit höherer physiologischer Relevanz sind erforderlich, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Verbindungen vor Zutritt zu klinischen Studien vorherzusagen. Vor kurzem haben in vitro-Standardzellkulturtechniken von zweidimensionalen Schichtkulturen zu dreidimensionale mehrzellige Modelle entwickelt, mit dem Ziel, die in vivo Gewebemikroumgebung nachzuahmen. Diese Systeme wurden bereits wesentliche Verbesserungen gegen genauere Vorhersage der Wirkungsweise der Verbindungen 1,2 gezeigt. Weiterhin Anpassung der in vitro-Kulturbedingungen für die hoch spezialisierten Anforderungen von Zellen ist von besonderem Interesse.
Unter Standardbedingungen in vitro, eine Vielzahl von wichtigen cultur Parameter wie Nährstoff und Versorgung mit Sauerstoff, die Entfernung von Akkumulieren Produkte und mechanische Kraft auf die Zellen wirkt, oft nicht vollständig in den meisten Fällen überprüft wird. Viele Organe besitzen physiologisch relevanten Konzentrationsgradienten von Stoffen und gelösten Sauerstoff. Allerdings sind diese hoch reguliert und optimierten Bedingungen in deutlichem Widerspruch zu den unkontrollierbaren Diffusionsgradienten um Gewebe unter in vitro Bedingungen, was zu einer sehr instabilen Umfeld und die Begrenzung der Zellentwicklung 3. Somit mäßigere und insbesondere mehr quantifizierbar in vitro-Bedingungen sind erforderlich, um Zellen über längere Zeit zu halten lebensfähigen und differenziert. Perfundiert Systemen, bei denen Komponenten des Mediums werden regelmässig entnommen und ersetzt, sind oft besser charakterisiert und kontrollierbar als statische Kulturen hinsichtlich der direkten Umgebung des Gewebes. Unter statischen Bedingungen Diffusionsgradienten Zellsekrete und das Kulturmedium Nährstoffekönnte kultivierten Zellen 3 umgeben. Einführung in gut charakterisierten mittleren Flussraten um das Gewebe ermöglichen die Zellsekret mit dem Vollmedium durch Perfusion mischen. Dies ermöglicht die Erzeugung definierter zelluläre Mikroumgebung, um eine stabile Zell Phänotyp und metabolisierende Enzymexpression in der ganzen Testzeit: 4.
Jüngste Entwicklungen in der Multi-Organ-Chip (MOC) -basierte Systeme kombinieren die Vorteile eines kontrollierten Medium Umströmung konstruiert Gewebe mit den kleinen, mittleren und Zellmasse Anforderungen der Mikrobioreaktoren, was zu einer reduzierten Menge an Substanz während der Prüfung erforderlich ist. Mehrere Mikrofluidik-Systeme für die Gewebekultur wurden bisher 5,6 beschrieben. Tissue-Fluid-Verhältnisse innerhalb dieser Systeme spielen eine besonders wichtige Rolle bei der Simulation von physiologisch relevanten Zellübersprechen. Aufgrund technischer Beschränkungen, wie die Verwendung von externen Pumpen und Medienspeicher, thE insgesamt zirkulierenden Mediavolumen in den meisten Systemen ist zu groß im Vergleich zu den Gewebevolumen. Die Gruppe von Shuler et al. Waren die ersten, ein System eine ordnungsgemäße Verweilzeiten von Stoffen in den Zellkulturräumen und in vivo relevanten Gewebe-zu-Flüssigkeitsverhältnisse 7,8 zu entwickeln. Dies wurde durch die Skalierung des externen Reservoir auf eine Platte mit 96 Vertiefungen, die auch für die "anderen Geweben" Raum erreicht. Um die zirkulierenden Mediavolumen innerhalb unserer MOC Plattform zu minimieren, haben wir ein Schlauch On-Chip-Mikropumpe, wodurch die Notwendigkeit für externe Medien Schaltungen. Diese Mikropumpe in der Lage ist, das System mit einer wählbaren Anzahl von Medienfließgeschwindigkeiten und Scherbeanspruchungsgeschwindigkeit 9 zu betreiben. Mikrofluidische Kanalsystem von 500 um Breite und 100 um Höhe verbindet zwei standardisierte Gewebekulturflächen, die jeweils die Größe einer einzelnen Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. Das Festhalten an der Größe der Industrie-Standard-Well-Plattes ermöglicht die Integration von bereits vorhandenen Gewebemodelle im Transwell-Format produziert. Weiterhin ist die vertikale Position der Transwell-Zellkultur-Einsätze einstellbar, so dass die Kultivierung der Gewebemodellen, die nicht nur direkt an den Fluidfluss ausgesetzt sind, können aber auch angehoben und von den Grundstrom abgeschirmt werden. Ebenso sind Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Kulturen möglich mit diesem System.
Das MOC-Plattform aus einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht 2 mm hoch ist und einen Glasobjektträger mit einer Grundfläche von 75 x 25 mm 2, die permanent durch Niederdruck-Plasmaoxidations gebunden sind, um die fluiddichte mikrofluidischen Schaltkreis zu bilden, hergestellt. Die PDMS-Schicht der jeweiligen Kanäle und Zellkulturabteile enthält, wird durch Standard-Weichlithographie und Replika Form 9 produziert. Die Mikrofluidik-Design der MOC in dieser Studie verwendet wurde, bestand aus zwei separaten mikrofluidische Schaltkreise pro Chip, die jeweils mit zwei Zell cultur Fächer durch ein Kanalsystem 100 & mgr; m hoch miteinander verbunden. Dies erlaubt die Leistung von zwei einzelnen zwei Gewebe Cokulturen mit einem Multi-Organ-Chip. Pumpfrequenzen wurden eingestellt, um mittlere Durchflussmengen von 40 ml / min zu erhalten.
Diese zweiGewebe MOC Gestaltung vorgesehen die Fähigkeit, eine Leber Sphäroid und eine Haut-Stanzbiopsie in getrennten Kulturräume Kokultur, wenn auch in einer gemeinsamen Medienschaltung unter physiologischen Flussbedingungen. Differentiated HepaRG Zellen wurden mit menschlichen Lebersternzellen (HHSteC) in einem Verhältnis von 24 zusammengefasst: 1, um eine homogene Sphäroide zu bilden. Dieses Verhältnis wurde als optimal herausgestellt, da in früheren Experimenten 10 beobachtet, obwohl fast das Doppelte der Anzahl der Leberzellen wurden verwendet, verglichen mit der in vivo Situation. Die Haut wurde in einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche in einem Transwell-Zellkultureinsatz kultiviert, so dass die topische Substanz Belichtung. Diese Gewebemodelle wurden für 28 d kokultiviertays im MOC, um die Vollständigkeit des Systems zu demonstrieren. Weiterhin wurde die mikrofluidische Kanalschaltung der Chips vollständig humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC) bedeckt, um das Gefäßsystem genauer zu simulieren.
Die hier beschriebene MOC-Plattform stellt ein stabiles und leistungsfähiges Werkzeug für den Anbau von Geweben unterschiedlicher Herkunft bei dynamischen Mediumströmungsbedingungen über längere Zeiträume Kultur 10,16. In diesem Beispiel wurde die Plattform verwendet, um primäre Zellen (HDMEC), Gewebeäquivalente aus einer Zelllinie erzeugt (Leber Aggregate) und eine Co-Kultur des vorgenannten mit einer Gewebebiopsie zu kultivieren. Das MOC konnte die drei Teil Kokultur für bis zu 28 Tage in einem kombinierten Mittelkreislauf aufrecht zu erhalten. Nach bestem Wissen der Autoren ist dies das erste Mal, ein Multi-Gewebe Kokultur einschließlich Biopsien, primären Zellen und Zelllinien wurde über vier Wochen durchgeführt.
Einer der größten Nachteile von mikrofluidischen Systemen ist die Affinität von kleinen Molekülen auf dem Oberflächenmaterial des fluidischen Schaltung haften. Da das Verhältnis Oberfläche zu Volumen insbesondere in mikrofluidischen Systemen hoch ist, wird dieser Effekt noch deutlicher 17 </sup>. Die stabile HDMEC Deckung der Kanäle, hier eingeführt wird, könnte als eine biologische Barriere, die das Anhaften von Molekülen an die MOC handeln. Ferner kann es als hemokompatible Gefäß für ganze Blutzirkulation dienen und verhindern die Blutgerinnung. Jedoch ist die Verwendung von Vollblut als Medium Substitution nicht durchführbar als eine vollständige Vaskularisierung der Organäquivalente ist noch nicht erreicht worden. Bestehende Arbeiten an der Gefäßversorgung von in vitro -generated Gewebe ist viel versprechend und weist den Weg für weitere Studien 18,19.
Es ist wohlbekannt, dass Hepatozyten neigen, ihre Leber-spezifische Funktionen über die Zeit unter statischen zweidimensionalen in-vitro-Kulturbedingungen 20 verlieren. Metabolisierenden Enzymen, wie das Cytochrom P450-Familie, sind von besonderer Bedeutung, wenn der Stoffwechsel einer bestimmten Medikament untersucht werden soll. Cytochrom P450 3A4, ein Enzym, das an der Biotransformation von vielen Fremdstoffen verwandt und Cytochrom-P450-7A, which in Gallensäuresynthese im MOC kultiviert über 14 Tage beteiligt sind, wurden in Leber exprimiert Aggregate. Dies weist auf die Erhaltung einer metabolisch aktiven Phänotyp, so dass für Studien zur Metabolisierung. Die erhöhte Albuminproduktion von Aggregaten in der MOC im Vergleich zu statischen Kulturen ist ein weiteres Indiz für eine ausreichende Kulturbedingungen. Die während dieser Studie beobachtet Albuminproduktionsraten waren vergleichbar oder sogar höher als von mikrofluidischen Chips, einschließlich HepG2 Zellen 21 erhalten zuvor berichteten Werten – 23, jedoch Werte erreichte nicht diejenigen von primären humanen Hepatozyten 24. Weiterhin MOC System in seiner temporären Layout nicht für eine separate Segregation von Gallen ermöglichen. Zellen in den Aggregat polarisiert und ausgebildet Gallenkanälchen artige Strukturen, wie von MRP-2-Färbung dargestellt. Allerdings wurden diese Kanälchen nicht zu einem technischen Kanal Sammeln der Galle verbunden. Diese nicht-physiologischen Mischunging der Galle mit der Blutkammer hat in einer künftigen Neugestaltung des Systems angesprochen werden.
Die Einstellung der Fließeigenschaften von großer Bedeutung ist 25, insbesondere im Hinblick auf die Gewebe gegen Scherbeanspruchung empfindlich, wie die Leber. Der Betrag der Scherspannung durch das Gewebe wahrgenommen kann auf zwei Arten geändert werden: Zum einen kann der Luftdruck benutzt Festlegung der Membrane der Pumpe zu drücken abgesenkt werden sollen, um Spitzenscherspannungswerte in dem System. Zweitens kann das Gewebe in einer extrazellulären Matrix Schichtung oder eingebettet in Transwell-Kulturplatten gezüchtet werden. Letztere schirmen die Gewebe von den Grundstrom mit einer porösen Membran. Diese Einstellungen müssen auf individueller Basis für jedes Organ Äquivalent vor Beginn der MOC-Experiment durchgeführt werden. Bei einer pulsatilen Betriebs 2.4 Hz, zum Beispiel, die zu einer hohen, aber immer noch physiologischen Herzaktivität von 144 Schlägen entspricht / min bei Menschen, die Scherspannung in der MessKanäle der mikrovaskulären Schaltung erreicht ca. 25 dyn / cm 2. Dies entspricht einer physiologischen Scherspannung bei dem höheren Ende der Skala in Mikrovaskulatur und ist deshalb gut geeignet für Versuche mit einer Endothelialisierung der Kanäle. Da jedoch die Strom mikrofluidischen Anordnung des MOC System präsentiert nur aus einer Medienleitung, die den zwei Organkompartimenten, einer Pumpgeschwindigkeit und Scherspannungsrate wurde für das gesamte System gewählt werden. Daher ist eine exakte Einstellung der Fließeigenschaften auf die Bedürfnisse jedes einzelnen Organs nicht immer durchführbar.
Weiterhin Sorgfalt bei der Anpassung der Zellen an das gemeinsame Medium entnommen werden. Die Zellen werden in der MOC in einem kombinierten Medienschaltung kultiviert daher keine einzelne Zellkulturmedien kann für jede Gewebemodell verwendet werden, ist der Standard für die in vitro Zellkultur. Eine minimale kombinierte Medienformulierung muss vorher und t definiert werdener Zellen brauchen, um stufenweise zu dieser neuen Medien angepasst werden. Ein Anpassungsverfahren von 80% / 20% alten zu den neuen Medien für zwei Tage, dann 50% / 50%, gefolgt von 20% / 80% und eine vollständige Austausch immer auf eine angemessene Zelllebensfähigkeit und Funktionalität der Kulturen in unserer Hand geführt.
Der Strom mikrofluidischen Anordnung des MOC System erlaubt die Co-Kultur von bis zu drei Geweben. A Kokultur von mindestens zehn wichtigsten Organe des menschlichen Körpers notwendig ist, um die Homöostase zu erreichen. Daher ist das vorgestellte System in der Lage, spezifische Gewebegewebeinteraktion, aber nicht die wahre systemische Reaktion auf eine Substanz vorherzusagen. Eine Weiterentwicklung des MOC mehr Organhöhlen sind vorgesehen. Außerdem wird die Gültigkeit des Systems ist es, mit einem Satz von Referenzverbindungen angezeigt. Vorzugsweise Verbindungen, die während der klinischen Studien (wie zB Troglitazon) gescheitert sind, für ihre Leistung in dem MOC untersucht werden. Während, ist eine echte Validierung solcher komplexen Systeme noch b behinderty die fehlende Standardisierung über Biomarker und Endpunkte für die funktionelle Bewertung, sammeln mehr Daten zur Toxizität Leistung dieser und ähnlicher Systeme wird ihre Zuverlässigkeit und Einsatzbereich zu erweitern.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert wurde, GO-Bio Grant No 0.315.569.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |