لقطة على نطاق الجينوم من المنظمين لونين والدول في<em> القيطم</em> الأجنة عن طريق رقاقة تسلسل

Summary

مسألة كيفية المنظمين والدول لونين لونين تؤثر على الجينوم في الجسم الحي هو المفتاح لفهمنا لكيفية اتخاذ القرارات في وقت مبكر مصير الخلايا في الجنين النامية. رقاقة تسلسل-النهج الأكثر شعبية للتحقيق ميزات الكروماتين في-والمستوى العالمي المبينة هنا للأجنة القيطم.

Abstract

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Introduction

The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly^1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency³. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes⁴. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)⁵. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes.

Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species—X. tropicalis and X. laevis—have now been released by the International Xenopus Genome Consortium⁶. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.

The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.^7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.

Protocol

ملاحظة: كل عمل القيطم يتوافق تماما مع الحيوانات المملكة المتحدة (إجراءات علمية) لعام 1986، التي ينفذها المعهد الوطني MRC للبحوث الطبية. 1. الاستعدادات تقدير عدد الأجنة المطلوبة للتجربة رقاقة (انظر المناقشة). إعداد الحلول التالية التي يتم تخزينها في RT: 500 مل من 10X مارك لتعديل قارعو الأجراس (MMR) دون EDTA، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 وتعقيمها بواسطة التعقيم (1 M كلوريد الصوديوم، و 20 ملي بوكل، 20 ملي CaCl 2، 10 ملي MgSO 4، 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.5) 10، 1 مل من شطف العازلة SDS (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، 1٪ SDS) و 1 مل من 5X DNA العازلة تحميل (0.2٪ أورانج G، و 30٪ الجلسرين، 60 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0). إعداد الحلول التالية التي يتم تخزينها في 4 درجات مئوية: 50 مل من HEG عازلة (50 ملي HEPES KOH-7.5 درجة الحموضة، 1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، و 20٪ الجلسرين)، 500 مل من مخازن استخراج E1 (50 ملي HEPES KOH-درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA. 10٪ الجلسرين، و 0.5٪ Igepal CA-630، 0.25٪ تريتون X-100)، E2 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي EGTA)، وE3 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1٪ Igepal CA-630، 0.25٪ نا-Deoxycholate، 0.1٪ SDS)، 500 مل من RIPA العازلة (50 ملي HEPES KOH-7.5 درجة الحموضة، 500 ملي LiCl، 1 ملم EDTA ، 1٪ Igepal CA-630، 0.7٪ نا-deoxycholate) و 50 مل من TEN العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، 150 مم كلوريد الصوديوم). يسجل ومقطع 15 مل مخروطي أنبوب البوليسترين في علامة 7 مل. استخدام هذا الأنبوب لاحتواء مقتطفات النووية تمر صوتنة. لتحليل ما بعد التسلسل، واستخدام الكمبيوتر التشغيل متعددة النوى على غرار يونكس مع 8 غيغابايت على الأقل من ذاكرة الوصول العشوائي و 500 GB مساحة القرص الحرة. تثبيت البرامج التالية محليا والتي تستخدم أكثر في سطر الأوامر: FastQC، البورشيد CASAVA 1.8 فلتر الجودة، بووتي 11، SAMtools 12، HOMER 13، MACS2 14، IGV 15،16، Cluster3 17، جافا تريفيف، BLAST + 18، وb2g4pipe <sup> 19. تحقق تعليمات التثبيت ومتطلبات المجمعين والبرمجيات طرف ثالث. بناء مؤشر بووتي لمواءمة قصيرة NGS يقرأ الجينوم القيطم. ويظهر مثال هنا لX. مداري الجينوم V7.1 (نوفمبر 2011)، والتي يمكن تحميلها كملف FASTA (genome.fa) من بروتوكول نقل الملفات الخادم Xenbase (/ مقهى / الجينوم / JGI). نقل ملف FASTA إلى الدليل الفرعي مؤشر بووتي. استخدام سطر الأوامر التالية (هنا بعد الحرف الفوري>) لإنشاء ملفات مؤشر xenTro7: > ربطة العنق والبناء /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7 > تصدير BOWTIE_INDEXES = / مسار / إلى / ربطة العنق / مؤشر / تحميل ملف الشرح الجين (GTF) من متصفح UCSC الجينوم أو موقع مرآة على الخادم نمر لأحدث الإصدارات الجينوم (genomes.nimr.mrc.ac.uk) عن طريق متصفح أدوات / الجدول. استخدام ملف الجينوم FASTA وملف GTF لتخصيص HOMER لالقيطم (على سبيل المثال، X. مداري الجينوم V7.1، – اسم xenTro7). بدلا من ذلك، استخدم الحزم HOMER بنيت قبل لبعض الإصدارات القديمة من الجينوم القيطم. > loadGenome.pl -اسم xenTro7 -org اغية -fasta /path/to/genome.fa -gtf مسار / إلى / genes.gtf إنشاء مسار الجينوم (.genome الملف) للمتصفح الجينوم IGV عن طريق تحميل ملف FASTA مفهرسة (genome.fa مع ملف genome.fa.fai في نفس المجلد) وملف الشرح (genes.gtf). إنشاء فهرس الجينوم سقالة (genome.fa.fai) للجينوم القيطم على النحو التالي: > samtools faidx /path/to/genome.fa استخدام BLAST + لتمرير الجينات علم الوجود (GO) حيث من عدة أنواع نموذج (البشرية، والماوس، الزرد، ذبابة الفاكهة والخميرة) على الجينات القيطم على النحو التالي: تحميل جميع متواليات الترميز (CDS) كملف FASTA واحد (cds.fa) من متصفح UCSC الجينوم عبر أدوات/ متصفح الجدول وتحديث BLAST + مع قاعدة البيانات BLAST مهيأ مسبقا من البروتينات غير زائدة (NR): > update_blastdb.pl NR البحث عن البشرية (txid9606)، والماوس (txid10090)، الزرد (txid7955)، ذبابة الفاكهة (txid7227) والخميرة (txid4932) بروتينات من موقع NCBI عن طريق وظيفة البحث المتطورة (HTTP: //www.ncbi.nlm.nih. GOV / البروتين / متقدم) وإرسال GI الناتجة (معرف تسلسل) القائمة (sequence.gi.txt) إلى الكمبيوتر. تعيين الجينات القيطم إلى البروتينات الأكثر مماثلة من القائمة GI عن طريق تنفيذ BLASTx مع بعض نتوقع (E) قطع قيمة (هنا 10 -20). تأكد من أن الشكل الناتج هو XML (-outfmt 5 -out blastx_results.xml). الاستفادة من المواضيع لتوفير الوقت (-num_threads) التي ترتبط مع عدد من النوى الكمبيوتر المتاحة. > blastx -db / مسار / إلى / NR -gilist /path/to/sequence.gi.txt -الاستعلام / مسار / طنس / cds.fa -evalue 1E-20 -outfmt 5 -out /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# المواضيع] فتح ملف b2gPipe.properties المجلد b2g4pipe مع محرر النصوص وتحديث خصائص قاعدة البيانات لDbacces.dbname = b2go_sep13 وDbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. b2g4pipe تشغيل من مجلد التثبيت. > جافا Xmx1000m حزب المحافظين *: تحويلة / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -في /path/to/blastx_results.xml النتائج -out / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot ملاحظة: مقتطفات هذا البرنامج GO حيث لكل BLAST ضرب ويعين لهم المقابلة الجينات القيطم (xenTro7.annot). ويمكن الاطلاع على إعدادات قاعدة البيانات الأكثر المحدث بموجب أدوات / إعدادات عامة / إعدادات DataAccess من تطبيق Blast2GO جافا ويب ستارت (انظر 9.11.1). 2. لونين عبر ربط إخصاب البويضات القيطم، دي هلام والثقافة مbryos وفقا لبروتوكولات القياسية 20. نقل الأجنة dejellied (بحد أقصى 2،500 X. المورق أو 10،000 X. مداري) في هذه المرحلة التنموية التي تهم 8 مل عينة قارورة زجاجية مع غطاء وغسلها لفترة وجيزة مرة واحدة مع 0.01x MMR. إصلاح الأجنة مع 1٪ الفورمالديهايد في 0.01x MMR (على سبيل المثال، إضافة 225 ميكرولتر من 36،5 حتي 38٪ الفورمالديهايد إلى 8 مل 0.01x MMR) لمدة 15 إلى 40 دقيقة في RT (انظر مناقشة للمرة التثبيت وعدد الأجنة المطلوبة في التجربة رقاقة). ملاحظة: الفورمالديهايد غير قابلة للتآكل وشديدة السمية. فمن الخطرة في حالة العين وملامسة الجلد، وعسر الهضم، واستنشاق. استخدام غطاء الدخان عند إضافة الفورمالدهيد إلى القارورة. وقف التثبيت عن طريق الغسيل لفترة وجيزة الأجنة ثلاث مرات مع MMR 0.01x الباردة. لا تدع السراج امبري اجراء اتصالات مع سطح السائل بسبب التوتر السطحي يسبب لهم للتمزق. قسامة الأجنة في 2 مل أنابيب microcentrifuge على الجليدبحد أقصى 250 الأجنة في أنبوب، التي تحتل حجم ما يقرب من 250 ميكرولتر (X. مداري) أو 600 ميكرولتر (X. المورق) قبل الفقس. ماصة بعيدا قدر MMR 0.01x وقت ممكن. تخطي الخطوة التالية إذا كنت لا تزال فورا مع الفرع 3. تتوازن الأجنة في 250 ميكرولتر من العازلة HEG البارد. مرة واحدة وقد استقر الأجنة إلى أسفل الأنبوب إزالة أكبر قدر من السائل ممكن والمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل. تخزين في -80 ° C. 3. لونين استخراج ملاحظة: استخراج التالية من لونين عبر ربط من أجنة القيطم يعمل بأكبر قدر من الكفاءة مع الزمن تثبيت أشار في الخطوة 2.3 و 50 و 80 X. مداري أو 25 و 40 X. المورق الأجنة لكل مل من العازلة استخراج E1، E2 وE3. ويتكرر كل خطوة الاستخراج، بحيث مطلوب مرتين حجم المحسوبة العازلة. لرفع مستوى استخدام متعددة 2 مل microcentriأنابيب fuge أو 50 مل أنابيب الطرد المركزي. الاحتفاظ بعينات ومخازن على الجليد أثناء استخراج لونين. تكملة كميات كافية من مخازن E1، E2 وE3 مع 1 ملم DTT وأقراص مثبط البروتياز. إذا كان أداء رقاقة مع الأجسام المضادة الفوسفات محددة، المزيد من مخازن الملحق مع 5 ملم ناف و 2 ملي نا 3 VO (4). التجانس الأجنة ثابتة مع E1 قبل pipetting صعودا وهبوطا. الخليط أجهزة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي (4 ° C) المبردة في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة (أو 5 دقائق في حالة استخدام 50 مل أنابيب). نضح طاف وأي الدهون التي تعلق على الحائط. و resuspend الكريات في E1. الاحتفاظ بعينات على الجليد لمدة 10 دقيقة. الطرد المركزي وتجاهل supernatants كما في الخطوة 3.2. و resuspend الكريات في E2. الطرد المركزي وتجاهل supernatants كما في الخطوة 3.2. كرر الخطوة 3.4، ولكن الحفاظ على عينات على الجليد لمدة 10 دقيقة قبل الطرد المركزي. و resuspend الكريات في E3. الاحتفاظ بعينات على الجليد لمدة 10 دقيقة على الأقل. الطرد المركزي وتجاهل سوpernatants كما في الخطوة 3.2. ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن تصبح resuspensions شفافة إلى حد ما. والمنظفات في E3 استخراج النوى عبر ربط من خلال تقديم معظم ما تبقى من الصفائح الدموية صفار القابلة للذوبان. الكريات في resuspend وبركة من نوى عبر ربط (الملونة عادة البني من حبيبات الصباغ insolubilized) في إجمالي حجم 1 مل من E3. تمييع عينة مع E3 إلى 2 أو 3 مل إذا يبدو لزج جدا ويصعب ماصة. الحفاظ على الجليد أو على 4 درجات مئوية على المضي قدما في الخطوة 4 على نفس أو اليوم التالي. المفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C لاستخدامها لاحقا. 4. الكروماتين تجزئة ملاحظة: يتم استخدام صوتنة على حد سواء لذوبان والقص لونين عبر ربط. وفيما يلي المعلمات لتشغيل Misonix Sonicator 3000 مجهزة microtip مدبب 1/16 بوصة وضميمة سليمة. في حالة استخدام sonicators الآخرين، اتبع توصيات الصانعين للقصعبر ربط لونين أو استخدام من 6 إلى 12 W لمدة 4 إلى 8 دقائق في المجموع. نقل العينة النووية من الخطوة 3.7 في أنبوب مبنية خصيصا لصوتنة (الخطوة 1.4). الحفاظ على عينة المبردة خلال صوتنة من خلال وجود أنبوب تعلق على كوب من البلاستيك 800 مل مملوءة بالماء الجليد عبر المشبك الحرارة القصير. ضع الكأس على مقبس المختبر. ضبط جاك بحيث يتم المغمورة في microtip sonicator في العينة إلى حوالي ثلثي عمق حجم وتركزت دون لمس جدار الأنبوب. يصوتن العينة لمدة 7 دقائق في المجموع، وتوقف كل 30 ثانية مع 1 دقيقة توقف. وضع السلطة إلى 1.0. بدء صوتنة وزيادة على الفور وضع السلطة (عادة من 2 إلى 4) للوصول إلى قراءة من 9 إلى 12 W. وقفة فورا إذا تبدأ العينة إلى زبد. إعادة الأنبوب وإعادة التشغيل عند زبد قد اختفى تماما. نقل لونين المنفصمة إلى ما قبل المبردة 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتدور بأقصى سرعة (> 15،000 x ج) لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل طاف إلى ما قبل المبردة 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. جمع 50 ميكرولتر من طاف (التي تحتوي على مثالي لونين من حوالي 400،000 أو أكثر من نوى) لتصور درجة تجزئة لونين (القسم 5). استخدام ما تبقى من طاف للرقاقة (القسم 6). عينات في مخزن 4 ° C لمدة يوم وتصل إلى واحد. عينات الإضافية تجميد كما مأخوذة (واحد لكل تجربة رقاقة) في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل في -80 ° C. 5. التصوير الكروماتين تجزئة إضافة 50 ميكرولتر من شطف العازلة SDS، 4 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم و 1 ميكرولتر من بروتين K (20 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر من طاف من الخطوة 4.6. احتضان لمدة من 6 إلى 15 ساعة (O / N) في التهجين وضع الفرن إلى 65 درجة مئوية. تنقية الحمض النووي باستخدام PCR عدة التجارية تنقية. إذا لزم الأمر، استخدام 3 M من خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) لضبط درجة الحموضة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. أزلDNA مرتين مع 11 ميكرولتر من شطف العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5). إضافة 0.4 ميكرولتر من ريبونوكلياز A (20 ميكروغرام / ميكرولتر) و 5 ميكرولتر من 5X DNA العازلة تحميل قبل تشغيل العينة كلها جنبا إلى جنب مع 100 نقطة أساس وسلم DNA 1 كيلو بايت على 1.4٪ هلام الاغاروز من قبل الكهربائي. لأفضل النتائج، وهلام وصمة عار مع آمنة النووي الحل تلطيخ حامض بعد الكهربائي. 6. مناعي لونين ملاحظة: في هذا القسم، استخدم المنخفض الاحتفاظ 1.5 مل أنابيب microcentrifuge و1 مل على الأقل من العازلة المشار إليه في أنبوب لغسل حبات مغناطيسية لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. قبل إزالة العازلة من الخرز، وترك الأنابيب في الرف المغناطيسي لمدة 20 إلى 30 ثانية في كل مرة أو حتى الحل هو واضح. نقل 10 إلى 30 ميكرولتر من طاف (لونين المنفصمة) من الخطوة 4.6 إلى أنبوب جديد لاستخدامه في وقت لاحق كما عينة المدخلات، والتي تتطابق مع ما يقرب من 1٪ من إجمالي الكروماتين تستخدم لالشذرة. تخزينها في 4° C حتى عينات رقاقة جاهزة لعكس اتجاه عبر وصلات. نقل لونين المتبقية لأنبوب جديد. للتجارب الشذرة-QPCR تتطلب عنصر تحكم الأجسام المضادة، وتوزيع كميات متساوية من لونين لاثنين من الأنابيب. إضافة الجسم المضاد الشذرة الصف (أو السيطرة الضد المقابلة) إلى لونين. كدليل الخام، استخدم حوالي 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل مليون الخلايا معربا عن حاتمة في المصالح. لتقدير أكثر دقة كمية من الأجسام المضادة المطلوبة لكل تجربة الشذرة، تشغيل الشريحة نفسها مع كميات مختلفة من الأجسام المضادة (على سبيل المثال، 0.25 ميكروغرام، 1 ميكروغرام و 2.5 ميكروغرام) ومقارنة العائد على السلبية والإيجابية تحكم مواضع من قبل الشذرة-QPCR (انظر القسم 10). كعنصر تحكم الأجسام المضادة، واستخدام المصل العادي من نفس النوع نمط إسوي والحيوان المضيف والأجسام المضادة. احتضان على محور دوار (10 دورة في الدقيقة) O / N عند 4 درجات مئوية. غسل كمية كافية من الخرز الأجسام المضادة متوافق المغناطيسية مرة واحدة مع E3 لمدة 5 دقائق لر 4 درجات مئوية. الاختيار مواصفات الشركة المصنعة للقدرة الأجسام المضادة ملزمة من الخرز (عادة 5 إلى 20 ميكرولتر من الخرز ربط 1 ميكروغرام من مفتش الأضداد). إضافة حبات غسلها إلى الضد قبل المحتضنة لونين. وعلاوة على ذلك احتضان على محور دوار (10 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ساعة. غسل الخرز أربع مرات (رقاقة-QPCR) أو عشر مرات (رقاقة تسلسل) مع العازلة RIPA قبل المبردة، ثم مرة واحدة مع قبل المبردة TEN العازلة. حمل فقط من هذه الخطوة إذا إجراء تجربة رقاقة وما يليها. غسلها في resuspend الخرز في 50 ميكرولتر من TEN عازلة في أنبوب. تجمع كل حبات من تجربة شريحة واحدة من قبل نقلهم إلى أنبوب واحد جديد. استخدام الحامل المغناطيسي والمبردة (4 ° C) الطرد المركزي في 1،000 x ج لجمع حبات في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل كسائل أكبر قدر ممكن من دون تعطيل بيليه من الخرز. قطاع الشذرة مواد من حبات الخرز عن طريق إعادة التعليق في 50 إلى 100 ميكرولتر من SDS شطف العازلة وvortexing لهم بشكل مستمر مع thermomixer (1،000 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. بعد ذلك الطرد المركزي بأقصى سرعة (> 15،000 x ج) لمدة 30 ثانية. نقل طاف (رقاقة شطافة) إلى أنبوب جديد. تكرار الخطوة الأخيرة والجمع بين eluates الشذرة. 7. لونين عكس عبر ربط وتنقية DNA إضافة ما يكفي من SDS شطف العازلة للعينة المدخلات (الخطوة 6.1) للوصول إلى حجم العينة رقاقة، وهو 100 و 200 ميكرولتر (الخطوة 6.10). تكملة كل من رقاقة وإدخال العينات مع 1/20 حجم 5 M كلوريد الصوديوم. احتضان عينات لمن 6 إلى 15 ساعة (O / N) عند 65 درجة مئوية في فرن التهجين. إضافة 1 حجم TE العازلة وريبونوكلياز ألف في 200 ميكروغرام / مل. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. إضافة بروتين K في 200 ميكروغرام / مل. احتضان لمدة 2 إلى 4 ساعة على 55 درجة مئوية. تنقية الحمض النووي عن طريق الفينول: الكلوروفورم: أيزو أميلي استخراج الكحول تليها الإيثانول هطول الأمطار على النحو المبين سابقا 9. لرقاقة تسلسل، إضافة 32ميكرولتر من شطف العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5) حل بيليه DNA. ترك عينات على الجليد لمدة 30 دقيقة لضمان أن DNA يذوب تماما. ملاحظة: مجموعات التجارية تنقية PCR لديها أقل الانتعاش DNA ولكن هي أكثر ملاءمة، ويمكن استخدامها لعينات الشذرة-QPCR. لرقاقة تسلسل، تحديد تركيز 1 ميكرولتر من رقاقة ومدخلات DNA استخدام أساليب تعتمد على التألق. اتبع تعليمات الشركة الصانعة وتأكد من أن تركيز الحمض النووي يندرج في نطاق الكشف موثوق من التألق. 8. رقاقة تسلسل مكتبة البناء والتحقق من صحة ملاحظة: طرق الحالية لإعداد مكتبة DNA تسمح بناء المكتبات عالية التعقيد لNGS 1-2 نانوغرام. على حساب بعض التعقيد والمكتبات يمكن أن تكون مصنوعة من اقل من 50 خريج من الحمض النووي (انظر الجدول مواد معينة / المعدات). استخدام نفس الكمية من الحمض النووي لكل من رقاقة ومكتبة الإدخال. لفترة وجيزة، لماكالبريد فهرستها (إقران النهاية) مكتبات رقاقة وما يليها، ورقاقة وDNA المدخلات تحتاج إلى أن تكون-إصلاحه نهاية، و ligated إلى محولات خاصة (انظر الجدول مواد معينة / المعدات)، وPCR تضخيم مختارة الحجم. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لجعل المكتبات رقاقة وما يليها. انظر المناقشة لمزيد من التوصيات. أزل كل مكتبة في 12 ميكرولتر من شطف العازلة وتحديد تركيز 1 ميكرولتر من كل رقاقة والمدخلات المكتبة باستخدام مقياس التألق. نتوقع تركيزات 5-25 نانوغرام / ميكرولتر. النظر في تخفيض عدد دورات PCR (أقل من 18 دورات) إذا تركيزات أعلى من 25 نانوغرام / ميكرولتر. ملاحظة: القياس الكمي الدقيق هو المفتاح لتحقيق نتائج NGS المثلى. المكتبات مع تركيزات منخفضة تصل إلى 1 نانوغرام / ميكرولتر بعد 18 دورات PCR يمكن أن تكون متسلسلة، ولكن في كثير من الأحيان هم من أقل التعقيد. استخدام 1 ميكرولتر من مكتبة لتحديد حجم التوزيع جزء وللتحقق من أي تلوث محول ديمر (الفرقة نحو 120 بي بي) من قبل جالقائم على الورك الكهربائي الشعري. كرر المرحلة الصلبة تنقية تجميد عكسها مع نسبة حبات إلى عينة من 1: 1 (بدلا من 1.6: 1) إذا كان يحتوي على مكتبة dimers محول. أداء QPCR على التحقق من صحة الإيجابية والسلبية مواضع التحكم (انظر القسم 10) للتحقق ما إذا كانت هناك ملاحظة اتجاهات مماثلة تخصيب DNA قبل وبعد إعداد مكتبة. إرسال مراقبة الجودة المكتبات المعتمدة للالتسلسل. 9. تحليل ما بعد تسلسل والتصور البيانات ملاحظة: في الوقت الحاضر، وغالبا ما تنفذ NGS بها في المنزل أو المرافق التجارية التسلسل (انظر مناقشة لبعض المبادئ التوجيهية NGS). الإخراج القياسي ملفات مفردة أو متعددة ضغط GZIP FASTQ (* .fastq.gz) تخزين الملايين من التسلسل يقرأ. عادة، يتم فصل بالفعل المضاعفة يقرأ وفقا لمؤشر ويحتوي كل قراءة معرف تسلسل وعلى درجة مراقبة الجودة (PHRED + 33 للالبورشيد 1.8+) لكل السفلىالدعوة الإلكترونية. هذا النهج هنا هو واحد فقط من العديد من الطرق كيفية تحليل البيانات NGS. ومما يشجع القارئ للتحقق ما إذا كان أي من أسطر الأوامر التالية تتطلب التغييرات هذا المجال تتقدم بسرعة والتحديثات التي تحدث بشكل منتظم. سلسلة ملفات FASTQ مضغوط غزيب والتحقق من جودة البيانات التسلسل باستخدام البرنامج النصي FastQC. تنفيذ هذا ومعظم الأوامر التالية لكل من رقاقة ومدخلات تسلسل البيانات (أمثلة أظهرت لرقاقة) من محطة: > القط /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz > fastqc ChIP.fastq.gz ملاحظة: يجب أن البيانات الخام من التسلسل الناجح لمكتبة رقاقة يليها عالية التعقيد، تمر معظم التجارب. فشل تنبع أساسا من يدير التسلسل الفقيرة والتحف الفنية التجريبية مثل منحازة التضخيم PCR أو تلوث محول. ومن المتوقع أن درجة معينة من الازدواجية (التكرار)، وزائدة عن الحاجة يقرأ يمكن أن تمثل بحسن نية تخصيب DNA <suP> 21. ومع ذلك، يمكن للمرء أن تقييد في وقت لاحق علامات قراءة – نهاية 5 'أو يقرأ – واحد لكل زوج قاعدة للقضاء على أي زائدة عن الحاجة يقرأ دون التأثير على حساسية الكشف عن القمم (الخطوة 9.4) 21. بيانات ما قبل عملية التسلسل لإزالة التلوث محول (homerTools تقليم -3 <محول تسلسل>) السماح عدم تطابق واحد (-mis 1). استخدام 20 قواعد الأولى من (فهرسة) محول (5 'إلى 3') الأقرب إلى جزء من DNA الفائدة على ربط (كما هو موضح لمحول المدرجة في جدول المواد معينة / المعدات). > GZIP -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vN> ChIP.fastq > homerTools تقليم -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis 1 -min 36 ChIP.fastq ملاحظة: إزالة تصفيتها يقرأ (-N) مطلوب فقط افتراضيا في ملفات FASTQ الناتجة عن البورشيد 1.8. تجاهل الأمر fastq_illumina_filter (أي. '| fastq_illumina_filter -vN')إذا نسخة قديمة من 1.8 إنشاء معرف التسلسل. محاذاة قبل المصنعة يقرأ الجينوم المرجعية (xenTro7) باستخدام بووتي. فقط تبقي تعيين فريد يقرأ (-m 1) باستخدام الإعدادات الافتراضية، أي القصوى اثنين عدم التطابق في القواعد 28 الأولى وبلغ إجمالي PHRED + 33 نقاط الجودة لجميع عدم التطابق في القراءة من القصوى 70. تقرير المحاذاة في شكل SAM (-S) . زيادة عدد ميغابايت في موضوع (–chunkmbs) إذا كانت الذاكرة هي جزء استنفدت: > ربطة -m 1 -S -p [# المواضيع] –chunkmbs [على سبيل المثال 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam ملاحظة: بووتي تتوقع PHRED + 33 نقاط جودة افتراضيا. تضمين خيار – phred64-quals إذا تم إنشاء الملف FASTQ مع PHRED + 64 درجات الجودة من خلال البورشيد أقدم من 1.8. استخدام الأوامر HOMER اثنين لتحويل المحاذاة (SAM) ملف إلى ملف العظيم الشأن (.bw): > makeTagDirectory الشذرة / -single -tbp 1 ChIP.sam > makeUCSCfile الشذرة /-bigWig / مسار / إلى / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1e7 -o ChIP.bw ملاحظة: يتطلب التحول مؤشر سقالة (genome.fa.fai) من الجينوم إشارة (الخطوة 1.8). هنا هو التعريف تقتصر على علامة واحدة لكل زوج قاعدة (-tbp 1) وتطبيع إلى 10 ملايين يقرأ (1e7 -norm). العظيم الشأن هي واحدة من الشكل المفضل لتصور حيوي لمحات لونين مع متصفح الجينوم مثل IGV (الخطوة 9.12). تحديد توزيع علامات (رقاقة -d /) في معالم الجينومية (على سبيل المثال، +/- 10 كيلو بايت مع 25 صناديق شركة بريتيش بتروليوم، -si زي 20000 -hist 25) مثل بداية النسخ (TSS، المثال المعروض هنا) وإنهاء ( تحويل النص إلى كلام) مواقع. تشغيل annotatePeaks.pl HOMER المخطوطة مع شروح القيطم xenTro7 (الخطوة 1.7): > annotatePeaks.pl خدمات الدعم التقني xenTro7 الحجم 20000 -hist 25 -d الشذرة /> ChIP_tagDensity.tss البحث قمم كبيرة من تخصيب DNA بين الشذرة(-t ChIP.sam) والإدخال (Input.sam -c) في X. مداري الجينوم باستخدام MACS2 مع 1٪ روزفلت قطع (-q 0.01) وشظايا الحمض النووي (بعد صوتنة) من 200 سنة مضت (–bw = 200) لبناء نموذج. إضافة –broad العلم لسطر الأوامر هذا إذا تتوقع توزيع واسعة من ميزة لونين من الاهتمام مثل علامات هيستون أو RNA البلمرة. > macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n الشذرة -g 1.4376e9 -q 0.01 –bw = 200 ملاحظة: حجم الفعال للX. مداري التجمع الجينوم V7.1 حوالي 1437600000 سنة مضت (1.4376e9 -g). MACS2 بإنشاء ملف BED (ChIP_peaks.bed) تجنيد قمم مع مواقعها الجينومية. قارن عدة لمحات لونين في شكل heatmap تتجمع: إنشاء مصفوفة توزيع العلامة من الدلائل كثافة سمة من الفائدة (-d الشذرة / other_ChIP /) في قمم MACS2 (على سبيل المثال، +/- 1 كيلو بايت مع 25 صناديق شركة بريتيش بتروليوم، الحجم 2000 -hist 25 -ghist): > annotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 الحجم 2000 -hist 25 -ghist -d الشذرة / other_ChIP /> ChIP.matrix استخدام واجهة المستخدم الرسومية من Cluster3 لتحميل ملف ChIP.matrix وهرميا تجميع هذه الكثافة العلامة على أساس المسافة الإقليدية الحد الأدنى لأقرب النقطه الوسطى. فتح ملف CTD ولدت في جاوة TreeView إلى تصور المجموعات. البحث عن الرواية والزخارف ملزمة المعروفة سابقا، والتي أثرت في مؤتمرات القمة الذروة +/- 100 سنة مضت (الحجم 200). استخدام annotatePeaks.pl لرسم خريطة الحوادث عزر ورسم كثافة عزر: > findMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / الحجم 200 -p [# المواضيع] > annotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1 > annotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif الحجم 800 -hist 25> motif1.density ملاحظة: البرنامج النصي infe findMotifsGenome.plRS إثراء من المقارنة لاختيارها عشوائيا تسلسل خلفية الجينات في المقام الأول. يتم حفظ عزر الرواية الأكثر المخصب تحت motif1.motif في شكل مصفوفة موقف الوزن. ومما يشجع القارئ لإثبات هذه النتائج مع غيرها من وسائل دي نوفو عزر اكتشاف مثل cisFinder 22 و 23 MEME. علق قمم عن طريق حساب المسافة إلى أقرب الجينات وتحديد عدد قراءة تطبيع في غضون 400 النوافذ سنة مضت (الحجم 400): > annotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 الحجم 400 -d الشذرة / الإدخال /> ChIP_peaks.genes تلخيص الانتاج باستخدام الأمر AWK التالية لسرد عدد (N)، والموقع وعدد قراءة تطبيع للدول، فرادى (R) وجميع (LR) قمم في أقرب (الهدف) الجين. > AWK "BEGIN {FS = ' ر'} 7 $> = -5000 && 7 $ <= 1000 {N [$ 8] و+ = 1؛ R [8 $] + = $ 9؛ LR [8 $] = LR [8 $] '، و# 39؛ $ 7 '(' $ 9 ')'} {END ل(ط في N) {الطباعة ط ' ر' N [أنا] ' ر' R [أنا] ' ر' SUBSTR (LR [أنا]، 2)}} 'ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary ملاحظة: رقم عقب $ يشير إلى رقم العمود، والتي قد تحتاج إلى تعديل لتتناسب مع ملف ChIP_peaks.genes بإنشائه في الخطوة السابقة. هذا نموذج نصي مرشحات من أصل قمم تتجاوز 5 كيلو بايت المنبع والمصب 1 كيلو بايت من TSS $ 7 و 8 دولار و 9 $ الرجوع إلى المسافة إلى TSS، معرف الجينات والفرز قراءة تطبيع في الذروة، على التوالي. إجراء تحليل للمصطلحات GO المخصب بين الجينات المستهدفة على النحو التالي: بدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية من Blast2GO من سطر الأوامر عن طريق جافا ويب ستارت (javaws) 19. > javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp اتبع التعليمات التي تظهر المطورين لتحميل الشرحملف لجينات القيطم (xenTro7.annot) كما ولدت في 1.9.4 وملف ثابت من الجينات المستهدفة المحددة. تأكد من أن معرفات الجينات نفسها وتستخدم في كل الملفات. تصور لمحات الكروماتين بإضافة العظيم الشأن (ChIP.bw، Input.bw) وملفات BED (ChIP_peaks.bed) في IGV من المسارات. البيانات تكمل مع RNA تسلسل المسارات إذا كان متوفرا لنفس المرحلة من التطور. حفظ نتائج الدورة. استخدام البرمجة منصات R (www.r-project.org) أو MATLAB لمزيد من التلاعب وتصور البيانات ولدت أعلاه. بدلا من ذلك، رسم قواعد البيانات صغيرة مع Excel. 10. الشذرة-QPCR لاختبار رقاقة وتأكيدا الشذرة تسلسل استخدام منصة على الخط Primer3 لتصميم الاشعال المحيطة حوالي 100 سنة مضت DNA عند 60 ° C (T م) على حد سواء الإيجابية مواضع (الذروة محددة) والسلبية السيطرة. تأكيد خصوصية التمهيدي باستخدام في سيليكون </م> البحث PCR تنفذ في متصفح UCSC الجينوم. إنشاء منحنى 8 نقاط قياسية من التخفيفات ثلاثة أضعاف بدءا من ما يقرب من 1٪ المدخلات أو استخدام 2 – ΔΔC (T) طريقة 8،24 لتقدير حجم تخصيب DNA. تنفيذ الوقت الحقيقي PCR في يثلث التقنية لجميع العينات، أي رقاقة، والسيطرة، وإذا لزم الأمر، وعينات منحنى القياسية. مؤامرة تخصيب DNA كنسبة مئوية من الحمض النووي المدخلات أو كنسبة من الشذرة مقابل العينة الضابطة في كل مواضع الإيجابية والسلبية السيطرة.

Representative Results

ومن المتوقع إذا تم تنفيذ بروتوكول جيدا النتائج مساوية لتلك المقدمة هنا والأجسام المضادة في استخدام هو من نوعية الشذرة الصف (انظر المناقشة). هذا البروتوكول يسمح استخراج النوى من الثابتة الفورمالديهايد الأجنة القيطم والقص الفعال لونين من قبل صوتنة (الشكل 1A-C). يظهر الكروماتين المنفصمة التوزيع غير متماثل من شظايا الحمض النووي التي تتراوح أساسا من 100 إلى 1،000 سنة مضت، وتبلغ ذروتها ما بين 300 و 500 سنة مضت (الشكل 1C). مطلوب الحد الأدنى من 50 خريج من الحمض النووي immunoprecipitated لجعل بنجاح تقرن نهاية مكتبة رقاقة يليها فهرستها مع تدرج DNA ذات الحجم المماثل (الشكل 2A). وينبغي أن تكون المكتبة خالية إلى حد كبير من dimers محول، والتي يمكن أن ينظر إليه على رحلاني في حوالي 120 سنة مضت. على التسلسل-عن طريق التخليق، ومعالجتها قبل يقرأ تم تعيينها إلى الجينوم (الشكل 2B، C). في تجربة ناجحة مع <eم> X. الأجنة مداري، عادة 50 إلى 70٪ من نهاية واحدة يقرأ من 40 سنة مضت يمكن تعيين فريد إلى الجمعية جينوم V7.1 مع الحد الأقصى اثنين عدم التطابق. في حين المدخلات يقرأ محاذاة بشكل موحد تماما في جميع أنحاء الجينوم، محاذاة رقاقة يقرأ النتائج في التخصيب حبلا الخاصة التي تكتنف ميزة لونين من الفائدة. وذلك لأن التسلسل جميع أجزاء من 'نهاية 5 (الشكل 2C) 25. تمتد في محاذاة في قراءة الاتجاه إلى متوسط ​​حجم جزء تنتج ملامح دقيقة لملامح الكروماتين واحدة مثل الأحداث عامل النسخ ملزمة. ويبدو أن هذه إشغال DNA كما تبلغ ذروتها عندما تصور في IGV أو أي متصفح الجينوم متوافق الآخرين. وتستخدم المتصلين الذروة مثل MACS لتحديد موقع هذه القمم (الشكل 3A). وقد تم تحديد هذه الطريقة عشرات الآلاف من مواقع الربط في X. مداري الجينوم لعوامل النسخ T-مربع مثل VegT 26. الشذرة-QPCR جتربةيجب الإدلاء بالبيانات تأكيد تخصيب المحليين وجدت من قبل الشذرة تسلسل (الشكل 3B). تجارب رقاقة يليها تسمح استكشاف خصائص الجينوم على نطاق من الميزات لونين. على سبيل المثال، وحساب توزيع قراءة على عناصر الجينومية مثل النسخ بداية والمواقع إنهاء يمكنها إبراز أية تفضيلات ملزمة المكانية حول الجينات (الشكل 3C). وبالمثل، يتم استخدام heatmap التوزيعات قراءة في مواقع الذروة إلى مقارنة ميزات لونين مختلفة على نطاق الجينوم على نطاق الشكل (3D). عوامل النسخ معينة ربط تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد. دي نوفو تحليل عزر من قمم الكامنة الحمض النووي الجيني يمكن استرداد هذا النوع من المعلومات بما في ذلك الزخارف التخصيب المشترك للالعوامل المشتركة المحتملة (الشكل 3E). الغالبية العظمى من الجينات المستهدفة تظهر الإشغال DNA في أقل بدلا من مستوى أعلى (الشكل 3F). ويبدو أن هذه الميزة خالية من نطاق أن يكون شائع جدا بين TRالعوامل anscription وتقترح أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الجينات المستهدفة وينظم مباشرة مع أهميتها البيولوجية 27،28. تحليل حيث GO المخصب أو سمات أخرى مثل التعبير التفاضلية من الجينات المستهدفة قد يزيد تكشف نظرة ثاقبة وظيفة بيولوجية من ميزة الكروماتين في الجنين القيطم (الشكل 3G). الشكل 1. الكروماتين الإجراء مناعي للأجنة القيطم. (A) هي الأجنة في هذه المرحلة التنموية التي تهم ربط تساهمي (عبر الارتباط) أي البروتينات المرتبطة الحمض النووي الجيني الثابتة الفورمالديهايد. على استخراج النووي (B)، تم تجزئة لونين عبر ربط لتضييق الحمض النووي الجيني ملزمة أو مواقع تعديل لونين عن طريق التقليل من DN المرافقةتسلسل (C). وفي وقت لاحق، وimmunoprecipitated شظايا لونين مع الأجسام المضادة الشذرة الصف لإثراء تلك التي تحتوي على حاتمة الفائدة (D). يتم تجريد DNA-immunoprecipitated شارك قبالة البروتين وتنقيته (E) قبل إنشاء مكتبة الشذرة جزء لNGS (الشكل 2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. رقاقة يليها إعداد مكتبة، والتسلسل عن طريق التوليف ورسم الخرائط والدعوة الذروة. (A) يعرض رحلاني مكتبة رقاقة يليها جيدة مع قوالب DNA من 250-450 نقطة أساس. هذه القوالب يترتب على إدراج DNA من الفائدة يحيط بها عالميا (58 بي بي) وفهرستها (63 بي بي) محول. (B) </قوية> الملايين من مجموعات، كل مجموعة تحتوي على مع قوالب متماثلة، من قاعدة متسلسلة من قاعدة في حضور جميع النيوكليوتيدات الأربعة التي تمتلك عكسها، fluorophore متميزة وخصائص إنهاء متطابقة. تتم معالجة الصور الفلورسنت في الوقت الحقيقي لاستدعاء قواعد المناظرة، التي يتم تجميعها في نهاية المطاف إلى يقرأ. (C) يقرأ تلك الخريطة فريد لالجينوم القيطم يتم الاحتفاظ فقط. كما يتم التسلسل جميع شظايا من نهاية 5 '، ورسم خرائط لالشذرة يقرأ النتائج في قمم حبلا الخاصة التي تكتنف ميزة لونين من الفائدة. وبالتالي، المتصلين ذروة كشف عن تخصيب اليورانيوم التي تنبع من مناعي وتمديد يقرأ إلى متوسط ​​طول القطعة في توطين بدقة ملامح لونين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt = "الشكل 3" src = "/ الملفات / ftp_upload / 52535 / 52535fig3highres.jpg" /> الشكل 3. مثال على تحليل ما بعد تسلسل والتصور البيانات عن طريق عامل اقحي T-مربع النسخ VegT (zVegT). جميع قراءة التهم المعروضة هنا هي تطبيع إلى 10 ملايين تعيين فريد ويقرأ غير زائدة عن الحاجة. (A) مقتطفات ملف التعريف على نطاق الجينوم من zVegT ملزمة في X. الأجنة مداري المعيدة (المرحلة 11-12،5 بعد Nieuwkoop وفابر 29). كل الذروة، كومة المتابعة للبمد يقرأ، تمثل موقع واحد ملزم. وتسمى هذه القمم التي كتبها MACS2 مع معدل اكتشاف كاذبة (FDR) أقل من 1٪. يظهر كل جين mesp القريبة جدا والمنبع zVegT ملزمة، ولكن يتم التعبير عن mespa وmespb فقط من قبل تلك المرحلة (البيانات RNA يليها 30). (ب) مستويات الإشغال DNA من zVegT على النحو الذي يحدده الشذرة-QPCR في عدة مواضع (بما في ذلك غير المنطقة -bound 0.5 كيلوبايت المنبع من β -actin) confiRM إثراء محددة وجدت من قبل الشذرة تسلسل. مقارنة النتائج لmespa مع ذروة يسمى (شريط أحمر) في (A). هو تصور مستوى الإشغال DNA كنسبة مئوية من الدخل على حد سواء، ورقاقة مع الأجسام المضادة VegT (بولكلونل الأرنب من مفتش نمط إسوي) ورقاقة مع سيطرة الأجسام المضادة (مفتش أرنب عادي). أشرطة الخطأ تعكس الانحراف المعياري اثنين من مكررات البيولوجية. ويبين (C) Metagene تحليل zVegT تفضيلية ملزمة (العلامات اهمال أكثر من 25 بي بي) إلى المروج نسبة إلى أي منطقة الجينومية أخرى حول وداخل الهيئات الجينات. (D) يظهر Heatmap ك-المتوسط تتجمع مستويات (ك = 5) الإشغال DNA (العلامات اهمال أكثر من 25 بي بي) من zVegT وSmad2 / Smad3 (بيانات رقاقة يليها 31) نسبة إلى جميع المناطق متجهة الى zVegT في مرحلة المعيدة. وheatmap هو تسجيل 2 شهادة وتركزت في 5 علامات في بي بي. (E) دي نوفو تحليل عزر يكتشف الكنسي T-مربع النسخ عامل عزر ملزم في 38٪ من zVegT-المناطق ملزمة إذا كانت النتيجة عزر الأساسية هي تطبيع إلى معدل اكتشاف 5٪ في تسلسل الخلفية. وتظهر خريطة كثافة أعلى تخصيب لعزر T-مربع في وسط مواقع الربط zVegT، بينما بالكاد المخصب عزر Smad2 / Smad3 ملزمة الكنسي. (F) الرسم البياني يبين مستويات الإشغال DNA من zVegT، التي تحسب لكل الجين المستهدف من كل القمم (+/- 200 نقطة أساس) ما بين 5 كيلو بايت المنبع [-]. و1 كيلوبايت المصب [+] مواقع بداية النسخ المطابق (G) أعلى 300 الجينات مع أعلى مستويات الإشغال DNA داخل -5 كيلو بايت و +1 كيلو بايت هي المخصب لالعمليات البيولوجية من التطور الجنيني المبكر. هذه GO حيث تتماشى مع وظيفة المفترضة من zVegT. ويستند روزفلت في اختبار دقيق ثنائي الطرف فيشر وتصحيح لاختبار متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ويحدد بروتوكول لدينا كيفية جعل وتحليل الجينوم على نطاق ملامح لونين من أجنة القيطم. وهو يغطي كل خطوة من البروتينات عبر ربط مواضع الذاتية في الجسم الحي لمعالجة الملايين من يقرأ تمثل مواقع الجينومية المخصب في سيليكون. منذ أعدادا متزايدة من مسودات الجينوم متوفرة، وينبغي أن يكون هذا البروتوكول ينطبق على الكائنات الحية وغير نموذج نموذج الأخرى. قسم تجريبي أهم، والذي يحدد هذا البروتوكول بصرف النظر عن الأعمال السابقة ^{8،31،33،34،} هو الإجراء بعد تثبيت لاستخراج النوى عبر ربط. فإنه يسهل كفاءة solubilisation لونين والقص وسهلة الارتقاء. جنبا إلى جنب مع كفاءة محسنة لإعداد مكتبة هذا البروتوكول يسمح بناء عالية التعقيد، المكتبات رقاقة وما يليها من نصف إلى مليوني الخلايا معربا عن حاتمة المصاحب لونين من الفائدة. للتجارب الشذرة-QPCR، وعدد قليل عشرة آلاف من هذه الخلايا تكون عادة كافيةللتحقق من تخصيب DNA في ستة مواضع ربما الجينومية متميزة. هذه الأرقام هي تقديرات متحفظة، ولكن قد تختلف اعتمادا على البروتين مستوى التعبير، وجودة الأجسام المضادة، عبر ربط الكفاءة، وحاتمة للمعاقين. كدليل، والقيطم جنين واحد يحتوي على حوالي 4،000 خلايا في مرحلة منتصف الأريمة (8.5 بعد Nieuwkoop وفابر ^29)، 40،000 الخلايا في مرحلة متأخرة المعيدة (12) و 100،000 الخلايا في مرحلة tailbud في وقت مبكر (20).

الوقت المحدد لتثبيت مناعي فعال يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا عن طريق رقاقة-QPCR (المادة 10). بشكل عام، يطلب من الأوقات تثبيت أطول إذا كانت التجربة تتضمن X. المورق الأجنة، مراحل النمو المبكرة، وDNA خصائص ملزمة ضعيفة (أو غير المباشرة). ومع ذلك، فمن غير المستحسن تحديد القيطم الأجنة أطول من 40 دقيقة، أو تجهيز المزيد من الأجنة مما هو مذكور (القسم 3)، ويصبح لونين القص أقل كفاءة. ومن المهم عدملاستخدام أي الجلايسين بعد تثبيت وهذه الخطوة مشتركة لتبريد الفورمالديهايد يمكن أن تجعل استخراج النووي من أجنة صفار الغنية صعبة للغاية. حاليا، والسبب في ذلك غير معروف. فمن المتصور أن ناتج إضافة الفورمالديهايد جليكاين يتفاعل أكثر مع الأمينية مجموعات أو بقايا أرجينين ³⁵ N-المحطة.

الجسم المضاد هو مفتاح أي تجربة الشذرة وتحتاج إلى ضوابط كافية لتنفيذها لإظهار خصوصيته لحاتمة ذات الاهتمام (انظر المبادئ التوجيهية التي كتبها Landt وآخرون ^36). إذا لم يكن هناك الأجسام المضادة الشذرة الصف هو متاح، وإدخال الموسومة حاتمة البروتينات الانصهار المقابلة قد يكون بديلا مشروعا وهذه البروتينات يمكن أن تشغل endogeneous مواقع الربط ^37. في هذه الحالة، الأجنة uninjected هي الأفضل لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية بدلا من رقاقة مع المصل غير محددة. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الاستراتيجية إذا يتم التعبير عن بروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة مما أدى إلى انتعاش الفقراء من ENRIDNA جنة التعليم العالي.

كما لصنع المكتبات رقاقة وما يليها، وذلك بسبب انخفاض كمية من الحمض النووي في الاستخدام، فمن المستحسن أن تختار لإجراءات التي تقلل من عدد من الخطوات التنظيف والجمع بين ردود الفعل للحفاظ على أي فقدان DNA كحد أدنى. محولات والاشعال يجب أن تكون متوافقة مع تسلسل متعدد ومنصة NGS (انظر الجدول مواد معينة / المعدات). إذا باستخدام Y-محولات (التي كانت تحمل أسلحة واحدة الذين تقطعت بهم السبل طويلة)، فمن الأهمية بمكان ما قبل تضخيم المكتبة مع 3-5 جولات من PCR قبل إدراج DNA-اختيار حجم (على سبيل المثال، من 100 إلى 300 بي بي) من قبل الكهربائي للهلام. الغايات واحدة الذين تقطعت بهم السبل تسبب شظايا الحمض النووي للهجرة بتباين. محاكمة يدير مع كميات مختلفة من الحمض النووي المدخلات (على سبيل المثال، 0.1، 0.5، 1، 2، 5، 10 و 20 نانوغرام) ينصح لتحديد العدد الإجمالي للدورات PCR (أقل من أو يساوي 18 دورات) المطلوبة لجعل حجم مكتبة -selected 100 إلى 200 نانوغرام. تقليل عدد دورات PCR يجعل تسلسل reduيقرأ أقل احتمالا ndant. المرحلة الصلبة الخرز تجميد عكسها جيدة تنظيف الكواشف لاسترداد بكفاءة DNA من الاهتمام وموثوق إزالة أي محولات حرة وdimers من ربط وردود الفعل PCR.

من حيث عدد ونوع وطول يقرأ، حول 20-30000000 نهاية واحدة يقرأ من 36 سنة مضت يكفي بالنسبة لمعظم التجارب رقاقة يليها لتغطية الجينوم القيطم كله مع عمق كاف. الآلات NGS الأكثر انتشارا هي قادرة بشكل روتيني لتلبية هذه المعايير. ومع ذلك، قد يكون من المفيد لزيادة عدد من يقرأ إذا كان من المتوقع لتوزيعات واسعة من يقرأ، كما لوحظ مع بعض التعديلات هيستون، بدلا من قمم حادة. بالنسبة للعديد من التجارب رقاقة وما يليها، من 4 إلى 5 مكتبات المفهرسة مختلفة يمكن تجميعها والتسلسل في تدفق واحد حارات خلية باستخدام آلة NGS عالية الأداء. أحيانا المستحسن أيضا لتمديد طول القراءة وتسلسل طرفي القالب الحمض النووي (إقران النهاية) لزيادة mappability ثالدجاجة تحليل لونين داخل المناطق الجينومية المتكررة.

وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح إلى مجموعة واسعة من الميزات لونين مثل عوامل النسخ، وسطاء الإشارات والتعديلات هيستون ما بعد متعدية. ومع ذلك، الأجنة تكتسب درجة متزايدة من عدم التجانس الخلوية لأنها تطوير وتصبح ملامح لونين من الصعب تفسير. وقد بذلت خطوات واعدة في نبات الأرابيدوبسيس وذبابة الفاكهة إلى المناظر الطبيعية لونين الأنسجة تحديدا لمحة عن طريق استخراج نوع محدد خلية نوى ^38،39. ويتضمن بروتوكول لدينا خطوة استخراج النووية، التي يمكن أن تمهد الطريق لأنسجة محددة الشذرة تسلسل في الأجنة الأخرى.

Materials

1/16 inch tapered microtip	Qsonica	4417	This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica.
8 ml glass sample vial with cap	Wheaton	224884	8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps.
Adaptor	IDT or Sigma	NA	TruSeq universal adaptor, AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C.
b2g4pipe (software)	Blast2GO	non-commercial	http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip
BLAST+ (software)	Camacho et al.	non-commercial	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download
Bowtie (software)	Langmead et al.	non-commercial	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
cisFinder (software)	Sharov et al.	non-commercial	http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/
Chip for capillary electrophoresis	Agilent Technologies	5067-1504	Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C.
Chip-based capillary electrophoresis system	Agilent Technologies	G2940CA	The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C.
ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit)	Kapa Biosystems	KK8504	Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C.
ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit)	Rubicon Genomics	R40048	Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C.
Cluster3 (software)	de Hoon et al.	non-commercial	http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster
FastQC (software)	Simon Andrews	non-commercial	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
Fluorometer	life technologies	Q32866	Qubit 2.0 Fluorometer
Fluorometer reagents	life technologies	Q32851	The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature.
Formaldehyde	Sigma	F8775-4X25ML	Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic.
Gel (E-Gel EX agarose , 2%)	life technologies	G4010	Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature.
Gel electrophoresis system	life technologies	G6465	E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries.
Gel extraction kit	Qiagen	28706	Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice.
HOMER (software)	Chris Benner	non-commercial	http://homer.salk.edu/homer/index.html
Hybridization oven	Techne	FHB1D	Hybridizer HB-1D
IGV (software)	Robinson et al.	non-commercial	http://www.broadinstitute.org/igv/home
Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software)	Assaf Gordon	non-commercial	http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter
Java TreeView (software)	Alok Saldanha	non-commercial	http://jtreeview.sourceforge.net
Laboratory jack	Edu-Lab	CH0642	This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication.
Ladder, 100 bp	New England BioLabs	N3231	Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C.
Ladder, 1 kb	New England BioLabs	N3232	Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C.
Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes	life technologies	AM12450	nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml
MACS2 (software)	Tao Liu	non-commercial	https://github.com/taoliu/MACS
Magnetic beads	life technologies	11201D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads	life technologies	11203D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads	life technologies	10001D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads	life technologies	10003D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic rack	life technologies	12321D	DynaMag-2 magnet
MEME	Bailey et al.	non-commercial	http://meme.nbcr.net/meme/
Na3VO4	New England BioLabs	P0758	Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C.
NaF	New England BioLabs	P0759	Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C.
NGS machine	Illumina	SY-301-1301	Genome Analyzer IIx
NGS machine (high performance)	Illumina	SY-401-2501	HiSeq
Normal serum (antibody control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2028	Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Normal serum (antibody control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025	Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Normal serum (antibody control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2027	Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Nucleic acid staining solution	iNtRON	21141	Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature.
Orange G	Sigma	O3756-25G	1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C.
PCR primers	e.g., IDT or Sigma	NA	Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C.
MinElute PCR purification kit	Qiagen	28006	for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature.
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9)	life technologies	AM9730	Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible.
Primer3 (software)	Steve Rozen & Helen Skaletsky	non-commercial	http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Protease inhibitor tablets	Roche	11836170001	cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C.
Protease inhibitor tablets	Roche	11873580001	cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C.
Proteinase K	life technologies	AM2548	proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C.
RNase A	life technologies	12091-039	RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature.
Rotator	Stuart	SB3	Rotator SB3
SAMtools (software)	Li et al.	non-commercial	http://samtools.sourceforge.neta
Solid phase reversible immobilisation beads	Beckman Coulter	A63882	The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C.
Sonicator 3000	Misonix/Qsonica	NA	Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin.
Sound enclosure	Misonix/Qsonica	NA	optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure.
Thermomixer	eppendorf	22670000	Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C.