Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence
Summary
Le poisson zèbre est un outil populaire pour modéliser la maladie rénale chronique (CKD). Cependant, leur petite taille, il est impossible d'évaluer la fonction rénale en utilisant des méthodes traditionnelles. Nous décrivons une fluorescente reins de colorant jeu dosage qui permet une analyse quantitative de la fonction rénale dans le poisson zèbre CKD.
Abstract
L'embryon de poisson zèbre offre un modèle souple pour étudier l'organogenèse et modéliser les maladies génétiques humaines. Malgré sa simplicité relative, le rein et le poisson zèbre développe fonctions dans presque la même manière que les humains. Une différence importante dans la construction du rein humain est la présence de millions de néphrons par rapport au poisson-zèbre ne possède que deux. Cependant, la simplification d'un système aussi complexe en unités fonctionnelles de base a aidé notre compréhension de la façon dont le rein développe et exploite. Chez le poisson zèbre, la ligne médiane située glomérule est responsable de la filtration du sang initial en deux tubules pronephrique qui divergent afin de fonctionner bilatéralement long de l'axe embryonnaire avant de fusionner les uns aux autres au cloaque. Les tubules pronephrique sont fortement peuplées par des cils mobiles qui facilitent le mouvement de filtrat le long du tubule segmenté, permettant l'échange de différents solutés avant de finalement sortir via le cloaque 2-4. De nombreux gènes responsables de la maladie rénale chronique, incLUDING ceux liés à ciliogenèse, ont été étudiés chez le poisson zèbre 5. Cependant, une attraction majeure de retour a été la difficulté d'évaluer la fonction rénale poisson zèbre après manipulation génétique. Essais traditionnels pour mesurer le dysfonctionnement du rein chez l'homme ont prouvé non translationnelle poisson zèbre, principalement en raison de leur environnement aquatique et de petite taille. Par exemple, il ne est pas physiquement possible d'extraire le sang de l'embryon organisé poissons pour l'analyse de l'urée et de la créatinine contenu, car ils sont trop petits. En outre, le poisson zèbre ne produisent pas suffisamment d'urine pour tester sur une simple protéinurie 'jauge', qui est souvent effectuée lors des examens initiaux des patients. Nous décrivons un dosage par fluorescence qui utilise la transparence optique du poisson zèbre pour contrôler quantitativement le dégagement d'un colorant fluorescent, au fil du temps, du système vasculaire et en sortie par le rein, pour donner une lecture de la fonction rénale 1,6-9.
Introduction
Le rein humain joue un rôle crucial dans le filtrage des déchets métaboliques du sang et la récupération de solutés nécessaires pour maintenir l'homéostasie cellulaire. Il existe un certain nombre de maladies génétiques humaines qui provoquent un dysfonctionnement rénal. La maladie rénale héréditaire la plus fréquente est autosomique polykystose rénale dominante (PKD) caractérisé par le développement des sacs remplis de fluide dans les tubules néphrétiques; les dommages causés par la cystogénèse est préjudiciable à la fonction rénale 10. ADPKD a une occurrence de 1: 800-1: 1000 et représente 8 à 10% des patients en insuffisance rénale au stade terminal (ESRF) 11. Plusieurs gènes ont été impliqués pour provoquer ADPKD y compris polycystine-1 (PKD1) et -2 (PKD2), représentant environ 85% et 15% des cas respectivement 12,13. En outre, les produits de gènes pour PKD1 et -2 localiser le cil et sont fondamentales pour ciliogenèse 14,15. Il ya maintenant une famille reconnue de troubles génétiques humains, connus sous le nomles ciliopathies, qui affectent la fonction des cils et se traduisent par CKD 16.
Le nombre croissant de maladies génétiques humaines qui affectent le développement et la fonction ciliaire suscite l'intérêt mondial dans cet organite résiduelle autrefois considéré. Le cil, une saillie cellulaire ressemblant à des cheveux, est enrichi avec les récepteurs et les canaux nécessaires à la transduction des événements de signalisation cellulaire clés d'ions. Le cil est constitué d'une base de axoneme microtubules, typiquement structuré en neuf doublets de microtubules disposés radialement, avec ou sans une paire centrale de microtubules de singulet. La structure de axonémale définit le type et le mode d'action ciliaire. L'arrangement des microtubules 9 + 2 confère à la motilité du cil où il est utilisé dans le déplacement des fluides à travers les surfaces epitheliales. La configuration 9 + 0 est non mobiles, mais est considéré principalement fonction des événements de signalisation cellulaire 17. En dehors de CKD, les conséquences de la dysfonction ciliaire sont un ensemble de caractéristiquescaractéristiques de ciliopathie qui comprennent, l'obésité, la dégénérescence rétinienne, une polydactylie, et la déficience cognitive 16. Cependant, CKD est parmi les plus préjudiciables à la qualité de vie du patient et donc une force motrice majeure derrière le développement de appropriée dans des modèles in vivo pour ciliaire liés CKD.
Le poisson zèbre est un excellent modèle pour comprendre l'étiologie de la maladie génétique humaine. Leur développement rapide, la production d'un grand nombre d'œufs, tissu transparent, et la croissance ex utero permet processus de développement de poisson zèbre pour être visualisées et événements biologiques manipulés avec beaucoup d'aisance. Les gènes peuvent être génétiquement modifiés en utilisant le récent succès d'outils d'édition de génome (CRISPR 18 et 19 TALENS), renversé en utilisant la technologie antisens morpholino 20, ou pharmacologiquement réglementés par l'addition de composés à leur environnement aquatique. En effet, le poisson zèbre offre une plate-forme pour entreprendre eXperiments qui ne sont pas permissives dans d'autres modèles animaux. Alors que le poisson-zèbre sont des vertébrés relativement simples (par rapport à l'homme), ils partagent de nombreux organes fonctionnellement conservés, des gènes et des processus de signalisation en commun avec les humains. Par exemple, le rein poisson zèbre est remarquablement similaire en structure et la fonction par rapport à l'homme 21,22. Cependant, contrairement au rein de mammifère qui se développe à travers une succession de phases, chacune marquée par un rein plus développé (pronéphros, mésonéphros métanéphros), et, le poisson zèbre embryonnaire ne se développe un pronéphros, la forme la plus immature d'un rein. Alors que des millions de néphrons peuvent être trouvés formant les blocs de construction de rein de mammifère, l'embryon de poisson zèbre possède seulement deux. Le glomérules, qui permettent pour le filtrat sanguin initial, sont fusionnés à la ligne médiane ventrale juste à l'aorte. filtres de sang dans les glomérules dans les tubules pronephrique qui se exécutent caudale long de l'axe, la fusion avant la sortie via le cloaque. Le pronephrique tubules sont fortement ciliés de cils motiles qui sont permissives pour l'écoulement du filtrat vers la sortie caudale 3,4. Cette structure pronephrique simples maintient l'homéostasie poisson zèbre par plusieurs semaines de croissance larvaire où ils finissent par se transformer en une structure plus complexe mésonéphros 21. Cependant, le poisson zèbre ne se développe jamais un métanéphros 21. Malgré les particularités de poisson zèbre, le néphron poisson zèbre est segmenté avec des profils d'expression génique égal à celui observé chez les mammifères et offre ainsi un incomparable modèle in vivo pour néphrogenèse 3,22.
Régulièrement patients sont testés pour la fonction rénale par une série de tests sanguins et urinaires. Typiquement, le sang est analysé pour les sels dissous, l'urée et la créatinine. Des niveaux élevés de l'urée, la créatinine et les concentrations de sel anormales sont révélateurs de problèmes avec la fonction rénale. L'analyse d'urine en utilisant une jauge colorimétrique détecte des niveaux anormaux de protéines, blood, du pus, de bactéries et de sucre présente dans les échantillons d'urine. Ces essais nécessitent normalement environ 30 ml d'urine ou de 5 à 10 ml de sang. Il a été difficile de traduire ces types d'essais à petite dans des organismes modèles in vivo, tels que le poisson-zèbre, principalement en raison de la nature impossible de collecter le sang ou l'urine suffisante pour réaliser le dosage. Ici, nous abordons l'absence de tests de la fonction rénale poisson zèbre appropriées et décrivons une technique innovante pour son étude. En injectant un colorant fluorescent dans le sang nous sommes en mesure de suivre et de quantifier individuellement dans le temps de la filtration et de l'excrétion de l'activité de fluorescence à partir du sang par les reins. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des dommages aux reins causée par la maladie, ce qui nous fournissons un exemple de.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poisson zèbre offre un outil précieux pour modéliser les maladies génétiques humaines, leur utilisation comme un instrument scientifique pour la recherche in vivo ont permis des études détaillées de la répartition génétique de nombreux systèmes biologiques, y compris le rein. Une grande partie est maintenant compris comment le rein poisson zèbre se développe et fonctionne. Les similitudes frappantes avec néphrogenèse humaine et d'homologie avec la maladie causant des gènes 21 a m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Assistance technique fournie par Jaipreet Bharj. Ce travail a été financé par des subventions du FP7-UE (SYSCILIA -241 955) et le rein Fondation néerlandaise (CP11.18).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
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