Abstract
المجهر متحد البؤر هو الأسلوب المفضل لتحليل توطين أنواع الخلايا متعددة داخل أنسجة معقدة مثل نخاع العظام. ومع ذلك، فإن التحليل النوعي والكمي لتوطين الخلوية أمر صعب، لأنها تعتمد في كثير من الحالات على العد والفرز اليدوي، وبالتالي تحمل مخاطر إدخال تحيز تعتمد على التصنيفات والحد من الموثوقية interrater. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يكون من الصعب الحكم على ما إذا كان في توطين التعاون بين خليتين النتائج من المواقع عشوائي، وخصوصا عندما تختلف أنواع الخلايا بقوة في وتيرة حدوثها. هنا، هو عرض طريقة لتقدير غير متحيز للخلوي شارك في التعريب في نخاع العظام. يصف بروتوكول إعداد العينة المستخدمة للحصول على أقسام النسيجية من بأكملها العظام الطويلة الفئران بما في نخاع العظام، وكذلك بروتوكول تلطيخ واكتساب صور عالية الدقة. سير عمل تحليل تمتد من الاعتراف المكونة للدم وغير همت-يتم تقديم أنواع الخلايا opoietic في 2 الأبعاد صور نخاع (2D) العظم لالكمي لاتصالات مباشرة بين تلك الخلايا. وهذا يشمل أيضا تحليلا الحي، للحصول على معلومات حول المكروية الخلوية المحيطة نوع من الخلايا معين. من أجل تقييم ما إذا كان المشارك توطين أنواع الخلايا اثنين هو مجرد نتيجة لتحديد المواقع خلية عشوائي أو يعكس الجمعيات التفضيلية بين الخلايا، وهي أداة المحاكاة الذي هو مناسبة لاختبار هذه الفرضية في حالة المكونة للدم وكذلك خلايا انسجة، هو المستخدمة. وهذا النهج لا يقتصر على نخاع العظام، ويمكن أن تمتد إلى الأنسجة الأخرى للسماح للتكرار، والتحليل الكمي للبيانات النسيجية.
Introduction
بسبب التطورات التكنولوجية السريعة التي حدثت مؤخرا في المجهر، بما في ذلك التصوير الضوئي، أصبح تحليل الخلايا داخل سياق الأنسجة كلها يمكن الوصول إليها على نحو متزايد لالمناعة. توصيف الخلايا واحد في تعليق يمثل طريقة قيمة والتي لا غنى عنها لفهم وظيفة الخلوية والجزيئية. ومع ذلك، فإن تحليل الخلايا داخل (الصغرى) بيئتهم -anatomical أمر ضروري لفهم التفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا التي تتعاون في العمليات المعقدة مثل تطوير الاستجابات المناعية.
في حين أنه من السهل نسبيا على المجاهر للحصول على المعلومات النوعية من الصور، فإنه لا يزال يشكل تحديا لقياس هذه البيانات، ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن طرق التحليل في هذا المجال لا تزال متخلفة بالمقارنة مع ما هو ممكن في الحصول على الصور. لا يزال كثير من الباحثين يعتمدون على العد اليدوي خلية في الصور الأنسجة التي تستغرق وقتا طويلا،وبالتالي إدخال التحيز بين المقيمون المختلفة والتي تعيق التكرار من قبل جماعات أخرى. في كثير من الأحيان، يتم اختيار صورة تمثيلية واحدة للتأكيد بيان على موقف الخلوي أو زملاء التعريب في منشور، مما يجعل من الصعب على القارئ للحكم على أهمية الإحصائية لمثل هذا الحدث.
جنبا إلى جنب مع حقيقة أن محتوى المعلومات كاملة من بيانات الصورة ونادرا ما تستغل، وهذا يؤكد على الحاجة إلى نهج أكثر متحيز وأسرع وشامل لتحليل الصور النسيجية.
نخاع العظم هو نسيج المعقدة، والتي تأخذ على الوظائف الحيوية الهامة بوصفها جهاز تكون الدم في الفقاريات الكبار. وبالإضافة إلى كونها مهد للخلايا المكونة للدم 1،2 ولعب دورا هاما في التنمية اللمفاويات B 3، فإنه يعمل أيضا كموقع حيث بدأت التفاعلات المناعية 4 ويدعم، وخلايا إعادة تدوير B الناضجة 5. وبالإضافة إلى ذلك، ودورها في الحفاظ على طأصبح ذاكرة mmunological تقدير متزايد في العقد الماضي، حيث تم العثور على عدة أنواع من الخلايا التي تشكل ذاكرة مناعية في الإقامة هناك 6-9.
العلاقة بين العمارة الأنسجة المعقدة للنخاع العظام وظائفها لا تزال بعيدة المنال. على عكس الأجهزة اللمفاوية الثانوية، التي يتم تنظيمها في مقصورات الكلية مثل مناطق خلية T و B، ونخاع العظام يفتقر إلى اضحة التقسيم الكلي. وحتى الآن تم تعريفها مقصورات متميزة في نخاع العظام بواسطة قربها من قشرة العظام أو الأوعية الدموية. أهمية مختلف السكان الخلية انسجة المقيمين في نخاع العظام لعدد من العمليات مثل دعم الخلايا الجذعية، وتطوير الخلايا البائية أو صيانة السكان خلية ذاكرة المناعة (مثل خلايا البلازما المعمرة (أجهزة الكمبيوتر)، CD4 + و CD8 + خلايا الذاكرة T) يشير بوضوح إلى أن هناك درجة معينة من التقسيم الجزئي في نخاع العظام.
وليس من الواضح لبعد ما مدى تتقاسم هذه المنافذ السمات المشتركة فيما يتعلق تكوين. من الخلوية والجزيئيةن، والتي تجعل عناصر مكانة معينة فريدة من نوعها. بالإضافة إلى خلايا انسجة، وقد ثبت أن أنواع الخلايا المكونة للدم للعب دورا حاسما من خلال توفير إشارات معينة على الأقل لبعض المنافذ. ومن الواضح أن تعقيد التركيبة المتخصصة يتطلب تحليلهم في الموقع، وأنها أصبحت ذات أهمية متزايدة للالمناعة وأمراض الدم لزوم في نخاع العظام المعمارية المصغرة، على سبيل المثال، من خلال تحليل العلاقات المكانية بين المكونات الخلوية لها.
هنا، ووضع استراتيجية لقياس شارك في توطين وحي علاقات الخلوية في نخاع العظام في طريقة تلقائية وغير متحيزة وتقدم. سير عمل مفصلة بما في ذلك جيل من الفئران خيالية، بإيواء الخلايا الفلورسنت انسجة والخلايا المكونة للدم غير الفلورسنت، وإعداد أقسام النسيجية من عظام undecalcified، والحصول على الصور مبائر تغطي العظم كله، فضلا عن تحليل الصور الآلي للج الخلويةوتقدم س التعريب ولها التحقق من صحة / التمييز من المواقع عشوائي من قبل أداة المحاكاة (الشكل 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الولائية المناسبة لرعاية الحيوانات (Landesamt FÜR Gesundheit اوند Soziales، برلين) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الحالية (رخصة التجربة الحيوان G0194 / 11).
1. جيل من الفئران نيون نخاع العظم همي
ملاحظة: جيل من نخاع العظام الفلورسنت الفئران خيالية لتصور خلايا نخاع العظم انسجة يتم تنفيذ كما هو موضح قبل 9.
- بدء علاج ديل-لجنة المساواة العرقية س الفئران ROSA-tdRFP (الفئران معربا عن جنبا إلى جنب البروتين الفلوري الأحمر (tdRFP) بتواجد مطلق 11-13) لإعدادهم للإشعاع. بدلا من ذلك، استخدام أي سلالة أخرى مع التعبير في كل مكان من البروتين الفلوري. إدارة 1 ملغ / مل من نيومايسين و 1 ملغ / مل من الفيتامينات (A، D3، E، C) عن طريق مياه الشرب قبل يومين من الإشعاع.
- أشرق الفئران مرتين مع 3.8 رمادي مع السيزيوم 137 غاما-irradiator وايرقيقة فاصل 3 ساعة. لهذا، وضع الفئران في قفص فطيرة التشعيع مناسبة لirradiator المعنيين.
ملاحظة: للإشعاع من الفئران، ومعهد لدينا لا تتطلب التخدير. اتبع سياسات المؤسسية المحلية بشأن التخدير لتشعيع. علاج الحيوانات مع 5 ملغ / كغ من تحت الجلد كاربروفين (الشوري) يوميا بعد التشعيع إذا كانت هناك علامات الألم. - في اليوم التالي، إعادة تكوين الفئران عن طريق الحقن في الوريد من 3 × 10 6 خلايا نخاع العظام المحضرة من العظام الطويلة من C57BL / 6 الفئران المانحة في نقل عازلة 9. الحفاظ على الفئران على نيومايسين والفيتامينات لمدة تصل الى 2 أسابيع ورصد رفاههم والوزن خلال هذا الوقت. انتظر 4 أسابيع على الأقل للسماح لإعادة تشكيل النظام المناعي قبل بدء العلاجات التجريبية محددة (على سبيل المثال، والتحصين) 9.
- التضحية الفئران ووضعها على لوحة التشريح، وتعقيم الساقين مع 70٪ من الإيثانول. Euthanizالفئران البريد وفقا للسياسات المؤسسية المحلية. معهدنا يقوم خلع عنق الرحم.
- استخدام ملقط ومقص لإزالة الجلد من الفخذين. إزالة الأنسجة العضلية لفضح عظم الفخذ. خلع عظم الفخذ من الورك ومفصل الركبة باستخدام ملقط ومقص. يجب الحرص على عدم كسر أو قطع العظام.
- إزالة بعناية المتبقية قطع كبيرة من الأنسجة العضلية والغضروف من العظام باستخدام المقص. إزالة الأنسجة العضلية المتبقية عن طريق فرك العظام مع المناديل الورقية المختبر. جمع العظام تنظيفها في طبق بتري مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إصلاح عظام الفخذ كلها في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA، والإلكترون المجهري الصف) ل4-6 ساعة.
- تجاهل PFA واحتضان العظام في 10٪ سكروز في برنامج تلفزيوني O / N. في اليوم التالي، واحتضان العظام في 20٪ سكروز O / N. في اليوم التالي، احتضان العظام في 30٪ سكروز O / N.
2. Cryosectioning من العظام
ملاحظة: بعد 16-24 ساعة في 30٪ سكروز، وتجميد العظام وcryosection لهم وفقا لطريقة كاواموتو في الشريط 14،15.
- إعداد كوب كبير (2،000 مل الحجم) مع الثلج الجاف والأسيتون (حوالي 2: 1 نسبة حجم، على سبيل المثال، 400 مل من الثلج الجاف و 200 مل من الأسيتون) تحت غطاء الدخان. وضع كوب صغير (150-250 حجم مل) مع الهكسان داخل (30 - 50 مل تقريبا). انتظر المزيج ليبرد (حوالي 10 دقيقة، حتى يظهر الصقيع على السطح الخارجي للكوب كبير).
- ملء ¾ من cryomold المسمى مع سوبر Cryoembedding متوسط (SCEM)؛ وضع بعناية العظام داخل حتى يتم مغمورة تماما أنهم، مع الحرص على أن لا تلمس حواف القالب. مع ملقط كبير عقد cryomold في الكأس مع الجزء السفلي من القالب مجرد لمس سطح الهكسان.
- السماح للالحواف الخارجية للتجميد SCEM (المشار إليها التعتيم، وهذا يستغرق حوالي 15 ثانية). ثم تراجع بشكل كامل القالب في الهكسان والسماح لها الصحائفإز ل1 - 2 دقيقة. إخراج العينة المجمدة والتفاف في السيلوفان ثم رقائق الألومنيوم (لحماية عينة من الجفاف، وتجنب التعرض للضوء). متجر في -80 درجة مئوية حتى cryosectioning.
- لcryosectioning من عظام الفخذ استخدام مشراح ومشراح القياسية شفرات لالأنسجة الصلبة.
- تعيين العينة وشفرة درجة حرارة مشراح إلى -24 ° C. السماح للعينة الجلوس داخل مشراح لمدة 15 دقيقة قبل القطع.
- إصلاح كتلة العينة إلى صاحب العينة المعدنية مع SCEM أو درجة الحرارة المثلى القطع (OCT) متوسطة. ضبط اتجاه من كتلة إذا لزم الأمر. تقليم العينة حتى يتم فتح العظم بشكل كامل ونخاع مرئيا. ضبط القسم سمك إلى 7 ميكرون (تجاهل القسم الأول).
- إصلاح قطعة من الشريط كاواموتو مع الجانب زجة على الجزء العلوي من كتلة العينة باستخدام ملعقة خشبية مغطاة الجلود الغزلان. وفي وقت لاحق، وقطع عينة وتحويل الشريط بحيث القسمالمتمركزة على الجانب العلوي. نقل الشريط إلى كوب الشريحة باستخدام ملقط. إصلاح الشريط إلى شريحة زجاجية مع لاصق شفاف.
- السماح أقسام تجف لمدة 30 دقيقة على الأقل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين الشرائح غير ملوثين وصاعد في صناديق الشريحة البلاستيكية التي تحتوي على الفواصل بين الشرائح واحدة من أجل تجنب أنها تلتصق ببعضها البعض. ويمكن تخزين الملون والتي شنت الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع في الكرتون المجلدات الشريحة في 4 درجات مئوية.
مجموعة 3. صورة
- ذوبان الجليد وcryosections وصمة عار وفقا لبروتوكولات المناعي المشتركة 9. تشمل وصمة عار النووية، على سبيل المثال، 4، 6-diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد (دابي) لتصور سلامة الأنسجة.
ملاحظة: وصمة عار، على سبيل المثال، لطلب تقديم العروض لتصور خلايا انسجة الحمضات وصمة عار مع الفئران مكافحة رئيسي البروتين الأساسي (ب ب) الأجسام المضادة ومكافحة الفئران اليكسا فلور 647 الضد (مكافحة RFP-البيوتين الأجسام المضادة وstreptavidin-فلور اليكسا 555)، والخلايا Bمع الفئران لمكافحة B220-اليكسا فلور 594 الضد وأجهزة الكمبيوتر مع الضوء مكافحة κ سلسلة فلوريسئين-ISO-ثيوسيانات (FITC) وأضداد λ1 ضوء سلسلة FITC (تم وصفها تفاصيل الإجراء تلطيخ في 9). - جبل أقسام الملون: وضع قطرة واحدة من fluoromount على القسم ومن ثم تغطية مع # 1 غطاء زجاجي زلة، في حين تجنب بعناية تشكيل فقاعات الهواء. وفي وقت لاحق، نفذ المسح بالليزر متحد البؤر المجهري مع أداة مجهزة خطوط الليزر مناسبة للتلطيخ.
- من أجل تسجيل الصور الآلي لتحليل شارك في توطين الخلايا المكونة للدم نخاع العظام مع خلايا انسجة باستخدام أداة Wimasis، وتطبيق الإعدادات التالية:
- استخدام 20X عدسة الهدف ومجال الرؤية من 708،15 العاشر 708،15 ميكرون. للتحليل الآلي، والحفاظ على حجم كل صور متناسقة في 2،048 خ 2،048 بكسل (بكسل) من اجل الحفاظ على نتائج قابلة للمقارنة.
- تسجيل قناة واحدة لهياكل اللحمية (على سبيل المثال، (على سبيل المثال، دابي، 405 نانومتر) وقنوات إضافية للخلايا المكونة للدم من الفائدة (على سبيل المثال، 3 قنوات، 488/594/633 نانومتر لالحمضات، وخلايا B وأجهزة الكمبيوتر).
- تسجيل صور باستخدام خط المتوسط 4 16. ومن الناحية المثالية، وتغطي القسم الفخذ كله من خلال اتخاذ الصور المتجاورة واحدة. بدلا من ذلك، والتقاط صور غير متجاورة من مناطق مختلفة من نخاع العظام (جدلي وكذلك المشاشية).
ملاحظة: يجب الحرص على عدم إنتاج التداخل بين الصور المجاورة (لتجنب تحليل المتكررة من الخلايا في المناطق المتداخلة).
- حفظ الصور في شكل ملف صورة المجهري. تحقق، وإذا لزم الأمر، وضبط التباين لجميع القنوات في برنامج عارض الصور / التحليل.
- تصدير 3 ملفات .jpg ولكل ملف صورة: ملف .jpg واحد للقناة دابي (أحمر / أخضر / أزرق (RGB) الشكل، اللون كاذبة مشفرة باللون الأصفر)، ملف .jpg واحد للقناة سدى (اللون الرمادي) و.jpg واحد ملف يحتوي علىقنوات الخلايا المكونة للدم (3 قنوات كحد أقصى، شكل RGB، على سبيل المثال، FITC (أجهزة الكمبيوتر، واللون كاذبة: الأخضر) / اليكسا فلور 594 (خلايا B، اللون كاذبة: الأزرق) / اليكسا فلور 647 (الحمضات، اللون كاذبة: أحمر)) .
4. الآلي تحليل الصور
- استخدام أداة تحليل الصور لأداء تجزئة الصورة، وتحديد حجم شارك في توطين وتحليل حي (انظر مناقشة).
- إذا باستخدام أدوات Wimasis، والمضي قدما على النحو التالي:
- تحميل مجموعات من 3 ملفات .jpg ولكل صورة مع اسم الملف نفسه تليها تسطير ورقم يشير إلى نوع من الصورة.
- استخدام _1 لملف .jpg مع الخلايا المكونة للدم، _2 لملف .jpg للقناة دابي، _3 لملف .jpg للقناة سدى. على سبيل المثال: Image1_1.jpg (الخلايا المكونة للدم)، Image1_2.jpg (قناة دابي)، وImage1_3.jpg (قناة سدى). تحميل الصور عبر حساب العميل.
- للاتصال خلية الكمياختيار أداة اتصال خلية عن طريق النقر على الحقل المعني. لمحيط الخلية الكمي، واختيار أداة محيط الخلية وتدخل في دائرة نصف قطرها محيط المفضل في ميكرون (الذي يقاس من حواف الخلايا ').
- تحميل النتائج.
ملاحظة: يتم توفير النتائج على شكل ملفات .jpg وتظهر الخلايا المكونة للدم وقناة سدى مع حدود الأجسام المكتشفة مظلل، وكذلك ملفات .csv واحدة تحتوي على قياسات كل صورة، بالإضافة إلى ملخص ملف csv أن يحتوي على البيانات لجميع الصور التي تم تحميلها.
- من الاتصال قياسات تحدد وتيرة الخلايا المكونة للدم (أحمر، أخضر، أزرق أو خلايا) في اتصال مع خلايا انسجة، أو الترددات من خلايا الدم الحمراء، الخضراء، الزرقاء أو الاتصال الأخرى أنواع الخلايا المكونة للدم (ويرد مثال في ممثل النتائج ، الشكل 4). من أجل تحديد الترددات، تقسيم التهم اتصال معين في الصورة عن طريقالخلية بحساب مجموع لكل صورة.
- لإجراء التجارب مع الفئران الفردية، نلخص العدد الكلى للاتصال من جميع الصور للفئران واحدة وتقسيمها على مجموع من إجمالي تعداد خلايا جميع الصور.
- من قياسات محيط، وتحديد وتيرة خلايا الدم الحمراء، الخضراء أو الزرقاء ضمن حدود المسافة مختارة من خلايا انسجة و / أو الترددات من خلايا الدم الحمراء، الخضراء أو الزرقاء في القرب فضل أنواع الخلايا المكونة للدم أخرى كما هو موضح في الخطوة 4.3 ( انظر أيضا ممثل النتائج، الشكل 4).
5. محاكاة عشوائية نخاع العظم لتحديد المواقع
- قبل تنفيذ عمليات المحاكاة لتحديد المواقع خلية عشوائي على نخاع العظم الصور النسيجية تحليلها، وإعداد الملفات التالية مقدما: ملفات .csv واحدة قدمت من قبل أداة اتصال الخلية، وملفات .JPG الأصلية للقناة دابي والملفات .JPG الأصلية للقناة اللحمية.
- من أجل أداءالمحاكاة دفعة على سلسلة من الصور (على سبيل المثال، فإن جميع الصور من القسم الفخذ واحد)، وجمع جميع الملفات .JPG الأصلية (_1، _2 _3 و) وملفات .csv واحدة المقابلة في مجلد واحد.
ملاحظة: أداة محاكاة لتحديد المواقع خلية نخاع العظم عشوائي متاحة عند الطلب. - بدء تشغيل أداة المحاكاة، والتحقق من مربع "لصناعة السيارات في تحميل بيانات الصورة".
ملاحظة: سيقوم البرنامج قراءة عدد الخلايا ومتوسط حجم الخلية من ملف .csv تلقائيا. يتم عرض هذه القيم في مربعات ل "عدد الخلايا" و "حجم خلية AVG" (الشكل 5A). - أدخل العلامة المشتركة للملفات. CSV، أي أن العامل المشترك في أسمائها. أدخل عدد مجموعات الصور التي ينبغي استخدامها لمحاكاة دفعة واسطة.
- تحميل ملف .jpg المتولدة من قناة سدى (مع اسم الملف إنهاء _3).
- إدخال الضبط لتوليد قناع من قناة دابي:
- ضع علامة في المربع "؟ تطبيق قناع "تعيين الحد الأدنى لتحويل الصورة إلى دابي قناع ثنائي إلى 10 (المدى 0-255).
- ضع علامة في المربع "8 بت؟" ضع علامة في المربع "تمدد؟" وتعيين درجة من التمدد إلى 5 بكسل. ضع علامة في المربع "ث / التآكل؟".
- أدخل القيمة المطلوبة لدائرة نصف قطرها محيط (دائرة نصف قطرها حي) المستخدمة لتحليل الصور المحاكاة. للحصول على صورة من 708.15 708.15 س ميكرون مع حجم 2،048 خ 2،048 بكسل (بكسل التحجيم س ص: 0.346 ميكرون)، 29 بكسل تتوافق مع 10 ميكرون.
- خانة الاختيار "استخدام أوتسو؟" لاستخدام خوارزمية أوتسو في 17 الكشف التلقائي للهياكل اللحمية.
ملاحظة: هذا هو نفس الخوارزمية المستخدمة من قبل اتصال والمنطقة المجاورة الأداة. باستخدام نفس خوارزمية تقطيع الصورة في التحليل الآلي للصورة المسجلة وصورة محاكاة أمر بالغ الأهمية من أجل الحفاظ على البيانات قابلة للمقارنة. - إدخال الضبط للخلايا المكونة للدم، والتي عالبريد محاكاة كأشكال دائرية.
ملاحظة: أرقام الخلية لخلايا الدم الحمراء، الأخضر والأزرق يتم تحميلها مباشرة من ملف .csv (انظر أيضا خطوة 5.6).- استخدام أداة محاكاة لحساب متوسط قطرها في مقصف من خلايا الدم الحمراء والخضراء والزرقاء. تحديد متوسط مساحة خلية واحدة كما إجمالي مساحة كل نوع من الخلايا في الصورة في مقصف مقسوما على عدد خلايا الكلي لكل صورة. استخدام متوسط مساحة لحساب نصف قطر القرص باستخدام الصيغة. ضعف نصف قطر لتحديد متوسط القطر.
- قياس توزيع حجم الخلية من أنواع الخلايا تحليلها مع أي برنامج تحليل الصور التي تتضمن وظائف تجزئة الكائن. تحديد σ لجميع أنواع الخلايا المكونة للدم (18 و الشكل 5B).
ملاحظة: بما أنه لا يتم تحديد حجم التوزيعات خلية من الخلايا التي سجلتها تحليل الصور الآلي، واستخدام توزيع جاوس كما تقريبي للتوزيعات حقيقية. عرض تييوصف انه منحنى التوزيع من قبل σ، ويمكن أن تكون مختلفة تماما عن أنواع الخلايا المختلفة. (لمزيد من التفاصيل، انظر الشكل 5B).- من هذه القياسات، وتحديد "حجم الخلية قطع": قطر في مقصف أن يصف أصغر الكائن لا يزال يعترف بها خلية كاملة من قبل أداة تحليل الصور.
- أدخل المعلمات في صناديق منهما على واجهة المستخدم الرسومية (الشكل 5A).
- أدخل حجم الخلية قطع، أي الحد الأدنى لحجم الخلية المسموح بها في المحاكاة، وقطر في مقصف.
- أدخل σ في مقصف لمحاكاة توزيع حجم الخلية لخلايا الدم الحمراء، الخضراء، والزرقاء (من الخطوة 5.9).
- ضع علامة في المربع "حذف" في القسم الفرعي "خلايا في قناع". مع هذا الإعداد، سيقوم البرنامج اختار وظيفة جديدة لخلية إذا كان يتداخل مع بكسل واحد على الأقل مع منطقة محظورة من القناع. ضع علامة في المربع "تجنب التداخل الخليوي؟ ̶1؛ في القسم الفرعي "استبعاد الخلية".
- أدخل الحد الأدنى للمسافة المسموح به بين مراكز خليتين في مقصف.
ملاحظة: يجب الحد الأدنى من المسافة يتم تحديدها من الصور المسجلة. خطأ مسافات الدنيا تقاس سيؤدي إلى متحيزة / النتائج اصطناعية للمقارنة بين الصور المسجلة والمحاكاة. - تعيين المساحة القصوى من التداخل إلى 100٪ إذا تم تعريف التداخل عن طريق الحد الأدنى للمسافة من مركز لآخر.
- تعيين أداة المحاكاة إلى 1،000 التكرار.
- ضع علامة في المربع "خلايا الحفظ التلقائي؟" لحفظ إحداثيات الكائنات محاكاة لجميع التكرار من كل صورة من الدفعة كملفات .rect (تنسيق النص). ضع علامة في المربع "صور الحفظ التلقائي؟" لحفظ ملف .tiff لكل صورة المحاكاة. أدخل علامة مشتركة لحفظ الملفات.
ملاحظة: "خلايا الحفظ التلقائي؟" الخيار يقلل محاكاة إدارة الوقت وحجم البيانات الإجمالي، مقارنة عند حفظ محاكاة معهد العالم العربي الفعليغيس. ملفات .rect حفظ إحداثيات الخلايا محاكاة مثل المستطيلات وبالتالي يمكن تحويلها إلى صور محاكاة إذا لزم الأمر.
- بدء تشغيل المحاكاة من خلال النقر على "محاكاة تشغيل".
ملاحظة: أداة محاكاة تلقائيا بإنشاء ملف .csv ل1،000 المحاكاة من كل صورة، بما في ذلك متوسط التهم الاتصال والتهم المجاورة لخلايا الدم الحمراء والخضراء والزرقاء مع خلايا الدم الحمراء والأخضر والأزرق، وانسجة لكل مجموعة من عمليات المحاكاة المتكررة . بالإضافة إلى ذلك، لجميع هذه القيم، وتقدم متوسطات 1،000 المحاكاة مع الانحراف المعياري (STD) والخطأ المعياري للمتوسط (SEM). - تحديد ترددات الاتصال والترددات مقربة من مجموعة واحدة من الصور 1،000 محاكاة المتوسط. لهذا، تقسيم متوسط الاتصال والتهم المجاورة من قبل عدد خلايا سجلت في الصورة. مقارنة الترددات إلى نتائج التحليل المشترك التعريب الآلي للصورة المسجلة.
- تطبيق الستاتي المناسبةطرق stical اعتمادا على تحليل 19 (الشكل 7 ل، استخدمنا قعت يلكوكسون ثنائي الطرف اختبار رتبة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قطع cryosections من العظام undecalcified مع أسلوب الشريط كاواموتو يسمح العظم كله لا بد من تخفيض باعتباره القسم سليمة، مع نخاع العظم من منطقة الطعوم لا تزال تعلق حتى العظم المعدنية، سواء في diaphysis وكذلك في مناطق المشاشية مع هم كثافة عالية من تربيقية العظام (الشكل 1). تلطيخ النووي الأقسام يكشف أنه على الرغم من الشقوق الصغيرة في إعداد لا يمكن تجنبها تماما، وهيكل من الجيوب والشرايين وكذلك شبكة شبكي من لحمة يبقى سليما.
وكمثال على ذلك من تلطيخ المناعي من أحمر فلوري نخاع العظام خيالية والتحليل لاحقا، يتم عرض تلطيخ لالحمضات (البروتين الأساسي كبير، ب ب)، وأجهزة الكمبيوتر (κ والضوء λ السلسلة) والخلايا B (B220). تم تحصين الفئران مع 100 ميكروغرام من 4 هيدروكسي-3-nitrophenylacetyl ناشبة بالإضافة إلى γ الدجاج الجلوبيولين (NP-CGG) في الشب الملكية الفكرية، وبعد 4 أسابيعإعادة، عززت مع 50 ميكروغرام من NP-CGG في برنامج تلفزيوني الرابع بعد 21 أيام وتحليلها في يوم 30 بعد دفعة. أسفر تحليل الصور الآلي في اعتراف دقيق جدا للهياكل اللحمية، بما في ذلك أيضا شظايا صغيرة جدا من عمليات شبكي. ولما كان عدد خلية من خلايا انسجة لا يمكن تحديده مع نظام المقدمة هنا (انظر أيضا مناقشة)، وقدم أي عتبة حجم للقناة انسجة، من أجل الكشف عن جميع شظايا في الصور (الشكل 2). أجهزة الكمبيوتر والحمضات أكبر من الخلايا البائية وتظهر أيضا شكل أكثر تجانسا. وكانت كل أنواع الخلايا الثلاثة المعترف بها جيدا للوهلة الأولى. مجموعات الخلوية، وخاصة الخلايا البائية، تم فصل جيدا. هو الأمثل لأداة تحليل لأنواع الخلايا المذكورة أعلاه (الحمضات، وأجهزة الكمبيوتر، والخلايا B). لأنواع الخلايا الأخرى، والتعديلات قد تكون ضرورية. ملفات .csv التي تم إنشاؤها بواسطة أداة اتصال خلية تحتوي على القياسات التالية ذات الصلة للخلايا المكونة للدم:عدد خلايا لكل سكان الخلية؛ تبلغ المساحة الإجمالية لكل سكان الخلية في مقصف. عدد اتصال من خلايا الدم الحمراء (في هذه الحالة الحمضات)، والخلايا الخضراء (هنا أجهزة الكمبيوتر) أو الخلايا الزرقاء (هنا خلايا B) مع خلايا الدم الحمراء، الخضراء، الزرقاء أو الرمادية (خلايا انسجة). ملفات .csv التي تم إنشاؤها بواسطة أداة محيط خلية تحتوي على القياسات التالية للخلايا المكونة للدم: عدد خلايا لكل سكان الخلية؛ تبلغ المساحة الإجمالية لكل سكان الخلية في مقصف. العد بالقرب من خلايا الدم الحمراء، الخضراء، والزرقاء مع خلايا الدم الحمراء والأخضر والأزرق، والرمادي (خلايا انسجة).
من أجل التحقق من صحة نوعية الأدوات تحليل الصور، وتمت مقارنة نتائج التحليل الآلي لتلك التي من العد والفرز اليدوي بنسبة 6 المقيمون تدريب (الشكل 3). تلقت كل المقيمون صور متطابقة للتحليل. وقد أوجز الهياكل انسجة والخلايا المكونة للدم بعناية مع أداة تحليل الصور وتم حفظها هذه المناطق من الاهتمام وتحليلها. لهياكل اللحمية، والمساحة الإجمالية لكل صورةكان مقارنة بين التحليل الآلي واليدوي. يبدو هياكل اللحمية ليكون من الصعب لذوي المرتبة المدربين على التعرف على وجه التحديد، وهو ما انعكس في تباين كبير احظ لحجم المساحة الإجمالية للسدى عدها يدويا (الشكل 3A). هنا، فإن التحليل الآلي تحديد قيمة قريبة من متوسط مساحة الكشف عنها من قبل ذوي المرتبة المدربين. لجميع الخلايا، قررت أداة التحليل الآلي كمية أقل قليلا من الخلايا من عدها يدويا. ومع ذلك، لأجهزة الكمبيوتر الشخصية والحمضات، كان عدد لا يزال في نطاق التباين interrater احظ لتهمة اليدوية. ومع ذلك، كان عدد الخلايا البائية الكشف عنها بواسطة تحليل الآلي أقل قليلا من هذا النطاق (الشكل 3A). وكان متوسط حجم الخلية (منطقة في بكسل) على النحو الذي يحدده التحليل الآلي 512 بكسل لأجهزة الكمبيوتر، 436 بكسل لالحمضات، و 317 بكسل للخلايا B، في حين قررت المقيمون مدربين بحجم 515 بكسل لأجهزة الكمبيوتر، 464 بكسل لالحمضات، و 291 بكسل للخلايا B. وهكذا، فإن متوسط جكان حجم الذراع لخلايا B، وأجهزة الكمبيوتر، والحمضات يحددها التحليل الآلي مماثلة لمتوسط حجم الخلايا التي يحددها المقيمون اليدوية (الشكل 3B). ويمكن الآن هذه الأداة تحليل الصور الآلي استخدامها لتحديد اتصالات مباشرة من نخاع العظام المرشح أنواع الخلايا المتخصصة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد وتيرة خلايا من نوع خلية معينة خلايا انسجة المجاورة أو غيرها من أنواع الخلايا المكونة للدم. تحليل لأجهزة الكمبيوتر نخاع العظام واتصالاتهم لانسجة الخلايا، الحمضات، وخلايا B، ويتم عرض أجهزة الكمبيوتر الأخرى، فضلا عن تردد من أجهزة الكمبيوتر أنواع الخلايا هذه المجاورة في غضون 10 و 20 ميكرومتر (الشكل 4A). بالإضافة إلى ذلك، ترددات الاتصال بمختلف أنواع الخلايا المكونة للدم مع سدى يمكن كميا (الشكل 4B).
قبل إجراء محاكاة عشوائي المواقع نخاع العظم من هذه الخلايا مع أداة المحاكاة، والمعلمات التي تصف توزيع حجم الخلية كما Gausتوزيع سيان لا بد من تحديدها. لتوزيع جاوس، والتي يمكن تصوره على هيئة منحنى "على شكل جرس" متناظرة و، تحتاج اثنين فقط من المعلمات ليتم تحديدها: موقع مركز المنحنى (الوضع، أي حيث يقع ذروة المنحنى ) وعرض منحنى متماثل (وهذا ما وصفت من قبل المعلمة σ المذكورة أعلاه). ويظهر هذا الإجراء هنا لأجهزة الكمبيوتر، الحمضات، وخلايا B (الشكل 5B). وتبين توزيعات حجم الخلية قياس ذلك، لخلايا B، وعرض منحنى التوزيع التي وصفها σ أصغر من لأجهزة الكمبيوتر الشخصية والحمضات. لالمحاكاة، والحفاظ على القيم النسبية للσ قياس للسكان الخلية الثلاثة (أي الخلايا البائية ومحاكاة دائما توزيع مرتين ضيق مثل حجم من أن أجهزة الكمبيوتر "والحمضات ')، في حين أن القيم σ المحددة في مقصف مجموعة لتتناسب مع المظهر المرئي للخلايا سجلت (الشكل6B). هذا أدى بنا إلى تطبيق σ من 2 بكسل للخلايا B وσ من 4 بكسل لكل من أجهزة الكمبيوتر الشخصية والحمضات. تم تحديد قطع حجم الخلية من التوزيعات قياس حجم الخلية. لأجهزة الكمبيوتر الشخصية والحمضات، وقطع في 300 بكسل حجم الجسم، مما أسفر عن 20 بكسل قطر لكائن دائري (حوالي 7 ميكرون)، وللخلايا B لقطع في 220 بكسل، مما يؤدي إلى قطرها 17 بكسل (حوالي 6 ميكرون) كان يستخدم لمحاكاة.
من أجل تحديد المناطق في صورة عشوائية محاكاة حيث يسمح للخلايا لتوضع من قبل أداة المحاكاة، ولدت قناع من إشارات النووية في قناة دابي من نخاع العظم الصورة النسيجية (الشكل 6A). تم تحديد قيمة 10 لتكون عتبة كثافة المثلى لتوليد الصور ثنائية (لوحة العلوي، والصورة الصحيحة). العتبة التي تحددها خوارزمية أوتسو للا يؤدي إلى الاعتراف الكامل من جميع نوى في الصورة (اللوحة العليا، صورة وسط)، على غرار كثافة ثابتةعتبات 50 أو 150 (اللوحة السفلى، واليسار والوسط الصورة) تم اختبار. وصلة من الاتصالات من أجهزة الكمبيوتر، الحمضات، أو الخلايا البائية مع الخلايا اللحمية (الشكل 4B) باستخدام أداة المحاكاة (الشكل 7). وكشف هذا التحليل أعلى بكثير معدلات الاتصال في الصور المسجلة مقارنة مع محاكاة لأجهزة الكمبيوتر الشخصية والخلايا B (الشكل 7A)، وذلك تمشيا مع مفهوم محاريب انسجة دعم هؤلاء السكان. وأكد ذلك في 5 الفردية الفئران خيالية الفلورسنت (الشكل 7B، D). في المقابل، تم تحديد أي اختلاف واضح في حالة الحمضات (الشكل 7A، C).
الشكل 1. نظرة عامة صورة مضان من المقطع الطولي للعظم الفخذ الفئران cryosectioned مع طريقة الشريط كاواموتو ل. طريقة الشريط يسمح cuttinز أقسام مع منطقة الطعوم سليمة، سواء في جدلي، وكذلك في مناطق المشاشية، من العظام undecalcified. كانت ملطخة A 7 ميكرون قسم العظام سميكة من السذاجة C57BL / 6 الماوس للبروتين المصفوفة خارج الخلية Laminin (الأحمر)، لهيئة السلع التموينية، 1 لتصور الشرايين (الخضراء) ونوى (الأزرق ودابي). 47 البلاط من 1،446 X 1،088 ميكرون، القرار تم تسجيل 1،360 خ 1،024 بكسل ومخيط لخلق صورة نظرة عامة. تم الحصول على هذه الصورة مضان المجهر واسعة المجال، مع 10X عدسة الهدف (0.45 NA). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الآلي الكشف عن خلايا انسجة ونخاع العظام المكونة للدم. وهناك قسم العظام الفخذ من الفلورسنت تشي الأحمركانت ملطخة ميريك الماوس على يوم 30 بعد دفعة لطلب تقديم العروض (الرمادي) لتصور سدى، MBP (الأحمر والحمضات)، وκ λ ضوء سلسلة (الأخضر وأجهزة الكمبيوتر) وB220 (الأزرق وخلايا B). اليسار: الصورة الأصلية حصلت على المجهر متحد البؤر، وذلك باستخدام 20X عدسة الهدف (0.8 NA) ومجال الرؤية من 708،15 العاشر 708،15 ميكرون. اليمين: صورة المقسمة. ويسلط الضوء على الخطوط العريضة للكائنات معترف بها. المستطيلات البيضاء بمناسبة المنطقة هو مبين في الصور أسفل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التحقق من تحليل الصور الآلي عن المقيمون المدربين. (A) المساحة الإجمالية للهياكل اللحمية ومجموع أرقام خلية من الخلايا المكونة للدم عدها من قبل ذوي المرتبة المدربين في واحد (هياكل اللحمية)، 10 (أجهزة الكمبيوتر)، وهما (الحمضات) وصورة واحدة (خلايا B) مقارنة مع أعداد الخلايا التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل الصور الآلي. وتمثل النقاط المقيمون الفردية (ن = 5-6). الحانات تشير إلى القيم المتوسطة أو القيم تحدد تلقائيا. حجم التوزيع (B) كائن من الكائنات عدها يدويا بالمقارنة مع متوسط حجم الكائن يحددها التحليل الآلي. وذلك لحساب لترددات مختلفة من أنواع الخلايا المختلفة، تم إحصاء أجهزة الكمبيوتر في 10، الحمضات في اثنين من وباء الخلايا في صورة واحدة. النقاط تمثل كائنات فردية. خطوط تشير إلى متوسط. (C) مخطط تفصيلي دليل الهياكل انسجة من قبل ذوي المرتبة المدربين. اليسار: الصورة الأصلية. الأوسط: أمثلة من الصور تحليلها يدويا. الحق: هياكل اللحمية الكشف عنها بواسطة التحليل الآلي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
"الشكل 4" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" العرض = "700" />
الشكل 4. تحليل الآلي شارك في توطين أجهزة الكمبيوتر، الحمضات، الخلايا البائية والخلايا اللحمية في نخاع العظم الفخذي. (A) اليسار: التردد من أجهزة الكمبيوتر في اتصال مباشر مع الهياكل اللحمية، الحمضات، الخلايا البائية أو أجهزة الكمبيوتر الأخرى في الفئران خيالية الفلورسنت في يوم 30 بعد دفعة. التردد من أجهزة الكمبيوتر في 10 ميكرون أو 20 ميكرون محيط محيط هياكل اللحمية، الحمضات، الخلايا البائية أو أجهزة الكمبيوتر الأخرى: الشرق واليمين. يتم تعديل أجزاء من هذا الرقم (اتصال مباشر، و 10 ميكرون المنطقة المجاورة) من Zehentmeier وآخرون. 9 (ب) تردد من أجهزة الكمبيوتر، الحمضات والخلايا B في اتصال مباشر مع الهياكل اللحمية. احصي 52-515 أجهزة الكمبيوتر، 918-3179 الحمضات، 4146-13063 B الخلايا في 10-21 الصور من 5 الفئران خيالية الفلورسنت في يوم 30 بعد دفعة، مجمعة من تجربتين مستقلة. وتمثل النقاط الفئران الفردية. خطوط تشير إلى متوسط.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تحديد توزيع حجم الخلية من أجهزة الكمبيوتر نخاع العظام، الحمضات والخلايا البائية. (A) لقطة من واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من أداة المحاكاة. (ب) توزيع حجم الخلية (منطقة في مقصف) من أجهزة الكمبيوتر (κ والضوء λ سلسلة والأخضر)، الحمضات (MBP والأحمر) والخلايا B يظهر (B220 والأزرق) في رسوم بيانية مقاسا بعد الاعتراف الكائن من قبل البرامج Volocity (اللوحة العليا). في الصور نخاع العظم الفخذ (اللوحة السفلى)، الكشف عن وتتميز أجهزة الكمبيوتر في الحمراء (تراكب الأصفر)، الحمضات في الأزرق (تراكب البنفسجي) والخلايا B باللون الأصفر (تراكب الرمادي). تم تنفيذ تقطيع الصورة عن طريق وضع عتبة الحد الأدنى من حجم 180 بكسل لأجهزة الكمبيوتر،300 بكسل لالحمضات و 220 بكسل للخلايا B. تم قياس 250 الأجسام للكمبيوتر، 650 الأجسام لالحمضات و 3،000 الأجسام للخلايا B. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. الجيل من القناع لمحاكاة المواقع خلية عشوائي. (A) وتظهر القناة الأصلية دابي (الصفراء)، وكذلك تراكب من دابي مع صور ثنائية الناتجة عن تطبيق مختلف العتبات. يتم عرض قناع المتولدة من صورة ثنائية (عتبة تعيين إلى 10) أدناه (اللوحة السفلى، الصورة الصحيحة). وتمثل المناطق السوداء محظورة المناطق، مناطق بيضاء تمثل المناطق التي يسمح فيها خلايا لتوضع. (ب) الصورة المسجلة (يسار) وصورة محاكاة المقابلة (يمين) تظهر ارتفاع البصريةأوجه التشابه. الحمضات (ب ب)، وأجهزة الكمبيوتر (κ وسلسلة λlight)، والخلايا B (B220) والخلايا اللحمية (RFP) يتم عرضها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. الاتصال المباشر من أنواع الخلايا المكونة للدم مع هياكل اللحمية في تسجيلها مقابل الصور المحاكاة. (A) تردد من أجهزة الكمبيوتر، الحمضات والخلايا B في اتصال مباشر مع سدى في محاكاة مقارنة الصور المسجلة من الفئران خيالية الفلورسنت في يوم 30 بعد دفعة. خطوط بالاتصال المقابلة محاكاة وسجلت الصور (نقطة). وتظهر الصور من الماوس ممثل واحد في كل قطعة. (B) ترددات من أجهزة الكمبيوتر، الحمضات والخلايا B في اتصال مباشر مع سدى في محاكاة مقارنة الصور المسجلة من 5 الفئران الفردية من تجربتين مستقلة. وقعت اختبار Wilcoxon رتبة، ثنائي الطرف (أجهزة الكمبيوتر: *** ع = 0.0001؛ * ع = 0.0371؛ * ع = 0.0161، ** ع = 0.0012. **** ف <0.0001، الحمضات: *** ع = 0.0007 ؛ P = 0.1055؛ * ع = 0.0161؛ ع = 0.4143. *** ع = 0.0007، خلايا B: **** ف <0.0001، ** ع = 0.0020. *** ع = 0.0005، ** ع = 0.0012 . **** ف <0.0001). وتمثل النقاط الصور الفردية. الحانات تشير إلى متوسط. تعتبر القيم P 0.05 اختلافات كبيرة. العلامات النجمية في الأرقام تشير القيم P التالية: نانوثانية: P> 0.05. *: ص 0.05. **: ص 0.01. ***: ص 0.001. ****: ص 0.0001. يتم تعديل أجزاء من هذا الرقم (الاتصال المباشر من أجهزة الكمبيوتر مع هياكل اللحمية) من Zehentmeier وآخرون. 9 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
700 "/>
وتنقسم التفاعلات الخلية اللحمية في نخاع عظام الفئران النهج في ثلاثة أجزاء رئيسية - الشكل 8. العمل الكامل للنهج الكمي للخلية المكونة للدم: مستعدون 1. أقسام نخاع العظام الفئران ويتم جمع البيانات الخام عن طريق المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري، 2. . يتم إجراء التحليل الآلي من الصور المسجلة ومحاكاة لتحديد المواقع العشوائي للخلايا نخاع العظام، وتتم مقارنة 3. التهم الاتصال وحي تم الحصول عليها من الصور المسجلة والمحاكاة. يشار إلى الإدخال (ملفات الصور) والإخراج (ملف نصي) للتحليل الآلي في الزرقاء، يشار إلى الإدخال (ملفات الصور) والإخراج (ملفات نصية، واختياريا، وملفات الصور) من أداة المحاكاة باللون الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من التقدم في أساليب التصوير البصرية الحديثة، لا يزال كثير من الأحيان أعاق تحليل البيانات النسيجي بسبب عدم وجود أدوات القياس الكمي المناسبة والأساليب، أو عن طريق التحليلات المغرضة التي تركز على منطقة صغيرة من الفائدة. نهج التآزر المقدمة هنا يجمع بين تحليل الصور التي تغطي كامل المنطقة نخاع العظام، وتجزئة الآلي والتعرف على الأشياء من مختلف أنواع الخلايا المكونة للدم واللحمية، وتحليل شارك في التعريب، وأخيرا أداة التحقق من الاتصالات غير عشوائيا تحدث يقدمها زبائن جدد برامج محاكاة تصميم.
وكانت الأنسجة من عظام كلها بما في ذلك نخاع العظام الصعب لأداء نظرا لمختلف الكثافات الأنسجة موجودة في مقطع واحد - على واحد يد من الصعب جدا، والعظام المعدنية، من ناحية أخرى نخاع هشا للغاية، والتي يتعطل بسهولة عندما قطع جنبا إلى جنب مع العظام. وكبديل لذلك، وطريقة الشريط لقطع أقسام العظام بريهented هنا 14،15 لديه ميزة أن يستقر في الأنسجة، مما يترك المجال لمناطق بطانة العظم سليمة (الشكل 1). وبالإضافة إلى كونها غنية بانيات، وقد اقترحت هذه المناطق لتلعب دورا في الجذعية صيانة الخلية 20.
الدور الحاسم للخلايا انسجة في العمليات التنموية وصيانة الخلوية في نخاع العظام أصبح من الواضح بشكل متزايد. ومع ذلك، فقد أثبت تحليل هذه الخلايا الهشة نادرة ليكون صعبا لسببين: أولا، أنها صعبة لعزل من نخاع العظام. ثانيا، درجة التجانس بين السكان انسجة لا يعرف، وبالتالي واحد قد تفوت على السكان المهم عن طريق استخدام العلامات معينة التي تم وصفها لخلايا انسجة، طريقة لتوليد الفلورسنت الوهم نخاع العظم هو مفيد لعلامة fluorescently وتحليل نخاع العظم السكان الخلية انسجة ككل في وقت لاحق. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه في هذه ميلوتصور م جميع خلايا اللحمة المتوسطة من نخاع العظام، بما في ذلك الخلايا البطانية وبانيات. هذا يحتاج إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار إذا تم تحليل البيانات من هذه الفئران خيالية. على الرغم من أن هناك أيضا خطر من الخلايا المكونة للدم من أصل المتلقي على قيد الحياة الإشعاع، وهذه الخلايا عادة فقط تغطي مساحة صغيرة جدا في مجال الرؤية مقارنة مع CD45 + الخلايا المانحة، وبالتالي لا تؤثر على التحليل النسيجي 9. بوضوح، ينبغي الجمع بين هذا الأسلوب في خطوة لاحقة مع كشف أكثر تحديدا من انسجة (دون) السكان. حاليا، يتم تحليل هذه الخلايا في الغالب من قبل الأنسجة وذلك للأسباب المذكورة أعلاه، وفرض حد على عدد من المعلمات التي يمكن تحليلها في نفس الوقت. تطوير متعددة المعلمة تحلل في المجهر سوف تساعد على التغلب على هذه الحدود.
خلال تحليل الصور، تم إجراء تجزئة باستخدام خوارزمية أوتسو الأصلية. أساسيا، وهذه الطريقة العتبة القائم على التجميع تلقائيا بتحديد عتبة كثافة للفصل الأمثل للالمقدمة (إشارة) وخلفية (الضوضاء) بكسل إلى مجموعتين مع أدنى اختلاف إحصائي في قناة معينة، مما أدى إلى صورة ثنائية (17). هنا، تم تطبيق طريقة أوتسو إلى نسخة اللوغاريتم الطبيعي من الصورة الأصلية، وهذا هو:
الصورة المدخلة لأوتسو = قانون الجنسية (صورة الإدخال)
هذا يعمل على نحو أفضل للصور مضان منذ طريقة أوتسو قد تحدد خلايا قاتمة كخلفية. إضافة وظيفة لوغاريتمي يسمح لفصل أفضل لخلايا والخلفية إلى فئتين مختلفة عن طريق خوارزمية أوتسو ل. ومع ذلك، وشدة العتبة وحدها ليست كافية للكشف عن الأجسام على وجه التحديد واحدة. وهو يعمل بكفاءة عندما كشف عن الأجسام فصل جيدا في الصور، ولكن ليس كافيا لخلايا مفردة منفصلة تقع ضمن مجموعات. وبعض من أنواع الخلايا التيتم الاهتمام بالنسبة لنا، مثل الحمضات أو الخلايا البائية، وكثيرا ما تتجمع معا في الأنسجة، ومجزأة النواة في قناة دابي باستخدام خوارزمية على أساس يعني ك تجميع الرسم البياني كثافة مع ك = 10 21. إن سوف خوارزمية تجزئة خلية مؤامرة ألمع إلى الأكثر خفوت بكسل (تتجمع في 10 صناديق) وننظر باستمرار لتشكيل كائنات تشبه خلية. وبعد ذلك يتم تعريف هذه الأشياء كما الخلايا. عندما استخدمت كل بكسل، والمتوسعة نوى مما أدى إلى توليد قناع أن يتم بعد ذلك تطبيقها على القنوات الأخرى للانفصال كتلة.
وتجدر الإشارة إلى أن هذا التحليل يعمل بشكل جيد للخلايا المكونة للدم التي هي المدمجة، ولكن ذلك غير محدود فيما يتعلق خلايا انسجة، كما أنه ليس من الممكن تحديد حدود هذه، خلايا انتشرت كبيرة نظرا للترابط بها ملحقات الجذعية التي تشكل شبكة شبكي. وهكذا، خلية بحساب للخلايا انسجةلا يمكن تقديمها. ووصفها الخلايا واحد عن طريق صحفيين مصير رسم الخرائط تحت سيطرة المروجين سدى محددة لحل هذه القضية، وفقا لما تم نشره عن الخلايا العصبية (باستخدام "Brainbow" نظام 22) وللوسم الخلايا الجذعية الجريبي في الغدد الليمفاوية 23.
بالإضافة إلى تطبيق خطوة الحد من الضوضاء لجميع القنوات من خلال استبعاد الأجسام أقل من 30 بكسل، تم تطبيق حجم الإقصاء في عملية الاعتراف الكائن للدم ولكن ليس انسجة الخلايا. شظايا صغيرة من الخلايا التي قطعت من قبل باجتزاء يجوز استبعاد. ومع ذلك، يمكن إهمال الخسارة في هذه الحالة لصالح اعتراف لا لبس فيه للخلايا. سوف تمتد التحليل والمحاكاة من سنتين إلى ثلاث أبعاد التغلب على هذا القيد. تطوير أساليب لدراسة توزيع الخلوي في يتصاعد كلها، على سبيل المثال، من خلال عدة الفوتون المجهري أو ضوء ورقة المجهري / SPIM، وسوف تساعد بالتأكيد في عشرهو احترام. من أجل دراسة التركيب الخلوي معقد من منافذ متعددة العناصر، سوف يصبح من الضروري أيضا تمديد عدد من المعلمات التي يتم تحليلها في الموقع. وقد تم نشر نهج واعدة لتحليل multiparameter المعلومات النسيجية في تركيبة مع cytometric الكمي مؤخرا 24 و 25.
تم إجراء تحليل الاتصال عن طريق قياس التداخل اثنين من الكائنات. وقد تم تعريف اتصال مباشر كما تداخل من بكسل واحد على الأقل. الأهم من ذلك، هذا التحليل محدود بسبب دقة الصور المجهري، وبالتالي يعتمد على الطول الموجي وطريقة الإثارة، وكذلك على الفتحة العددية للعدسة موضوعية المستخدمة في المجهر، وحجم الثقب. في التحليل هو موضح هنا، هدفا 0.8 NA، 20X مع مجموعات تألقي في منتهى السعادة مع 488، 561، 594، وطبق 633 نانومتر باستخدام أحد الإثارة الفوتون. وبالتالي، يقدر قرار الجانبي بينوقد حققت 0.372 0.483 ميكرون و. وهذا يسمح تأكيدات لبذل حول تجاور مختلف مجموعات فرعية الخلية؛ ومع ذلك، فإنه لا يعطي أي معلومات عن الآليات الجزيئية المفترضة تشارك في التفاعلات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى وسائل أخرى مثل 2-الفوتون intravital المجهري لتحسين خصائص هذه الاتصالات بين الخلايا 9. يمكن نقل الطاقة (الحنق) أنظمة المستندة إلى فورستر الرنانة يساعد على تأكيد ما إذا كانت هذه التفاعلات هي في الواقع الوظيفية 26.
من أجل تقييم المكروية الخلوية من محاريب الأنسجة، وليس فقط حاسما لتحليل الاتصالات الخلوية المباشرة، ولكن أيضا لتحديد أنواع الخلايا في حي من نوع خلية معينة من الفائدة ("تحليل محيط"). في السابق دراسات قياس المسافات بين الخلايا والهياكل الأنسجة التي نشرت مثل السفن على أساس الموقف من نواة 27. منذ كنا مهتمين determinجي المسافة من أنواع الخلايا المختلفة، في جزء منه مع نسب متفاوتة النووية للحجم حشوية، فضلنا لقياس المسافة بين السطوح. ولهذه الغاية، حسبنا نصف قطرها المجاورة عن طريق تحديد المسافة الإقليدية من الحدود cell's بعد تحويل القيم من ميكرون إلى بكسل. المسافة الإقليدية هي المسافة خط مستقيم بين اثنين بكسل ويمكن وصفها بواسطة الصيغة 28: 
احصي الخلايا مع بكسل حدودها ضمن المسافة الإقليدية من مثل 10 ميكرون من بكسل الحدود خلية الهدف كما المجاورة هذه الخلية.
في شكله الحالي، وتحليل يحدد فقط ما إذا كان يتم الاتصال خلية أو اقترب من خلية أخرى من نفس النوع أو مختلفة، وبالتالي توفير سوى ثنائي YES / NO التوصيف. العدد الفعلي للخليةلا يتم احتساب الصورة أن الاتصال الخلية من الفائدة أو ضمن دائرة نصف قطرها معينة منه. وستكون الخطوة التالية هي توسيع نطاق التحليل الحالي في هذه الطريقة أن حجم مجموعة من الاتصال أو الخلايا المجاورة يمكن أن يتم الكشف عن ومقارنة بين الخلايا المستهدفة المختلفة من نفس النوع. وسيؤدي ذلك إلى معلومات إضافية هامة حول تكوين منافذ نخاع العظام، مثل مكانة البقاء على قيد الحياة لخلايا البلازما نخاع العظام، والتي تم مناقشتها مساهمة متفاوتة من الخلايا المكونة للدم التبعي 29-33.
تم الأمثل خوارزميات التعرف على وجوه جنبا إلى جنب مع المختصين من Wimasis تستخدم المتاحة تجاريا خدمة حل عادتهم ومتاحة عند الطلب. وثمة خيار آخر هو استخدام إما البرمجيات المتاحة تجاريا لتحليل الصور، مثل Definiens، Volocity، أو Imaris، أو مجانية مثل CellProfiler.
تجزئة الخلايا وتحليل الصور الأدوات الآلية نحنإعادة التحقق من صحتها من خلال مقارنة النتائج مع البيانات التي تم تحليلها يدويا المقدمة من 6 المقيمون صورة المدربين فيما يتعلق معلمتين، وهي حجم الكائن وعدد الخلايا في السكان الخلية المختلفة. كما هو مبين في الشكل 3B، فإن متوسط حجم الجسم للخلايا المكونة للدم (أجهزة الكمبيوتر، الحمضات، وخلايا B) كانت مشابهة بين الطريقتين، مع التباين العالي اليدوي للتقرير لحجم خلايا البلازما والحمضات، ربما بسبب شكلها غير منتظم أكثر مقارنة إلى B الخلايا. كشف الآلي من الأرقام الخلوية ونتج القيم أقل قليلا من تلك الكشف يدويا. وتجدر الإشارة إلى أنها كانت لا تزال ضمن مجموعة من القيم اليدوية في حالة الحمضات وأجهزة الكمبيوتر، في حين أنها كانت أقل هذه القيم في حالة الخلايا B، وربما يرجع ذلك إلى عدم التجانس أعلى من التعبير عن B220، والذي تم استخدامه كعلامة لخلايا B. ومن المعروف B220 ليكون خلال B تمايز الخلايا في نخاع العظام ينظم يصل، والخلايا B مع انخفاض فضلا ط عاليةويمكن ملاحظة تلطيخ ntensity لB220. انخفضت خلايا B مع إشارات B220 منخفضة تحت عتبة التطبيقية، والتي قد أدت إلى استبعاد الخلايا مرحلة أقرب-B. انخفاض عتبة للكشف الآلي قد يحل هذه المسألة. للخلايا اللحمية، والتي هي أكثر صعوبة للكشف نظرا لأقل المدمجة، وأكثر تشعبا، والتشكل و-ممدودة، أدى الكشف اليدوي في الفروق بين ذوي المرتبة العالية الفردية. ومن المثير للاهتمام، كان متوسط مساحة إجمالية قدرها سدى مساوية لمساحة إجمالية تحدد تلقائيا، مشيرا إلى أن التحليل هو مناسبة تماما للتعويض عن التحيز الفردي من قبل ذوي المرتبة. أخذت معا، وهذه البيانات تظهر نتائج الآلي تمثل عادة متوسط قيم التحليلات اليدوية ومناسبة تماما للحد من تقلب interrater في التحليل.
من أجل التمييز المواقع العشوائية وغير العشوائية من الخلايا داخل القيود الهيكلية من الأنسجة، وقد تم تطوير أداة المحاكاة. الدرجي المحاكاة، يتم إنشاء صورة مصطنعة مع الخلايا المكونة للدم وضعه بشكل عشوائي لكل سجلت نخاع العظم الصورة النسيجية. أولا، يستخدم صورة قناة سدى في شكلها الأصلي. يتم إنشاء قناع من الصورة دابي من خلال تطبيق عتبة القائم على كثافة ثابتة، وبالتالي تحويل الصورة إلى تنسيق ثنائي. قناع ثنائي ثم يخضع لخطوات متعددة من تمدد بكسل القائم والتعرية. يحدد قناع المناطق في مجال الصورة التي يسمح فيها خلايا محاكاة لتوضع. يتم توفير إحداثيات مراكز الخلايا المحاكاة بواسطة مولد رقم عشوائي موحد، والحدود التي يتم تحديدها من قبل حجم الصورة. وتستخدم معلومات حول عدد الخلايا ومتوسط حجم الخلية لكل السكان يحددها تحليل الصور الآلي من الصور المسجلة لتعريف السكان الخلية المكونة للدم محاكاة. ويفترض قطر خلية محاكاة لمتابعة توزيع جاوس ذات بعد واحد من الذي الفعليةيتم تحديد قطرها خلية عشوائيا: ثم يتم تعديل القطر بحيث يتم عرض حجم الخلية خفض العرضية للالحد الأدنى لحجم الكائن المسموح به. في حالة أن تكون في وضع الخلية محاكاة مثل أن واحدا أو أكثر بكسل تتداخل مع منطقة محظورة أو يمكن أن تكون على مسافة محددة مسبقا من آخر خلية وضعت بالفعل (4 ميكرون من مركز لآخر كما هو محدد في الصور المسجلة)، الإحداثيات عشوائية جديدة وسيتم اختيار بينما يتم ترك قطرها دون تغيير. هذا سوف تتكرر حتى وصل عدد خلايا محاكاة يساوي عدد الخلايا في الصورة المسجلة.
واستند الأداة على افتراض أن الخلايا المكونة للدم يمكن وضعه بحرية داخل نخاع العظام، في حين تعمل هياكل اللحمية في شكل مصفوفة ثابتة داخل الأنسجة. وكان محسن الأداة إلى الوضع في نخاع العظام حيث عبرت المناطق متني من خلال نظام معقد من الجيوب. ونشرت نهج النمذجة مماثل مؤخرا من قبل Frenette وزملاء العمل من أجلتحليل المواقع من الخلايا الجذعية المكونة للدم في ما يتعلق خلايا انسجة والهياكل الأوعية الدموية، والتي تشكل حوالي 30٪ من إجمالي حجم نخاع العظم الفخذي 25. من أجل تصحيح لهذا الغرض، ويستند على أداة المحاكاة المعروضة هنا على قناع من المجالات ويسمح للخلايا لتوضع. وقد تحقق ذلك باستخدام صورة وصمة عار النووية، التي تم توسيع الكائنات التي تمثل نواة من 5 خطوات للدم (انظر الشكل 6) بعد binarization. والمناطق ذات الكثافة المنخفضة الخلوية، أي كثافة منخفضة من نوى مثل العظام والجيوب، وليس المساهمة في قناع وبالتالي أصبحت لا أذهب والمناطق. من أجل تجنب حدوث انخفاض الاصطناعي من هذه المناطق محظورة من قبل الإجراء تمدد، تم تطبيق 5 خطوات تآكل في وقت لاحق، وبالتالي إعادة فتح المناطق استبعاد أكبر، في حين ترك كثافة عالية النووية (وبالتالي "سمح") مناطق دون تغيير. هذه الطريقة يمكن تكييفها بسهولة لأجهزة اللمفاوية الأخرى. في تلك روكانت قضايا هذه الطريقة قد لا تعمل (على سبيل المثال، في المناطق التي الخلايا مع نسبة عالية السيتوبلازم / نواة موجودة)، وسائل أخرى مثل وضع العلامات حشوية يمكن استخدامها لإنشاء قناع.
تم محاكاة الخلايا المكونة للدم ككائنات الدائرية التي تم قياسها عن طريق استخدام مولد رقم عشوائي جاوس، متوسط التي وافقت مع متوسط قطرها المحسوبة لكل نوع من الخلايا الحجم. واستند العرض من التوزيع على توزيعات حجم الخلية تقاس الصور المسجلة على النحو الذي يحدده برمجيات تحليل الصور. من أجل أن تأخذ في الاعتبار أن شظايا الخلوية الصغيرة استبعدت في تحليل الصور الآلي، وأدخلت حجم الخلية قطع العرضية كما هو محدد من التوزيعات حجم الخلية محسوبة لكل نوع من الخلايا (انظر الشكل 5).
وبطبيعة الحال، فإن هذا يعمل بشكل جيد لأنواع الخلايا التي تكون موحدة نسبيا في حجمها وشكلها ولكنها قد تؤدي إلى مشاكل في حالة الخلايا التي لإعادة متجانسة إلى حد كبير فيما يتعلق بهذه المعلمات. وتجدر الإشارة إلى أن هذا التحليل هو الأمثل لأنواع الخلايا المكونة للدم الرئيسية في نخاع العظام (المحببة، الأسلاف المكونة للدم والخلايا الليمفاوية)، التي تشترك في أنها تمتلك، شكل مستدير تقريبا منتظم. ومع ذلك، لم يتم اختباره هذه الطريقة للخلايا الجذعية أو الضامة، أنواع الخلايا مع أجسام الخلايا غير النظامية بقوة. وتحليل مثل هذه الخلايا تشكل تحديات جديدة لدينا تحليل الصور الآلي، وكذلك لنهج المحاكاة، بما في ذلك الحاجة إلى تحسين خوارزميات العنقودية خلية الفصل 24 وكذلك مفصل شكل تحليل ومحاكاة ليس فقط خلايا مختلفة الحجم ولكن أيضا على شكل مختلف. وسيكون البديل نهج المحاكاة الذي يعمل مع الأشكال بالضبط كما هو مسجل. ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن هذا الأسلوب من شأنه أن يزيد بشكل كبير من سلوك حتمية للنظام نموذجي.
لبة محاكاةriments، تم إنشاء 1،000 التكرار من المحاكاة لكل صورة مسجلة. يمكنك استخدام هذا الكثير من التكرار تقليل الخطأ النسبي التي ساهمت عملية المحاكاة نفسها إلى حوالي 3٪. وهي، إذا تم احتساب القيم خلية خلية شارك في التعريب من عمليات المحاكاة التي هي عشوائية، ثم سوف تتميز عملية المحاكاة نفسها من خلال وظيفة الخطأ N -1/2، حيث N هو عدد عمليات المحاكاة في صورة قياسها. هذا هو مساهمة من عملية المحاكاة نفسها إلى الخطأ المتراكم من القيم شارك في توطين قياسها. وهكذا، على سبيل N = 1،000 الخطأ ساهم هو 3.16٪. ونشرت المحاكاة هو موضح هنا لمدة 20 إلى 60 دقيقة لكل صورة لكل 1،000 التكرار عند حفظ فقط الصور محاكاة كملفات .rect (شكل نصي) بدلا من الصور الفعلية كما هو الحال في .JPEG أو .tiff شكل (أيضا خيار في البرنامج ).
أخذت معا، وهذا النهج يسمح لغير منحازة، وتحليل الإنتاجية العالية من الصورة النسيجيةالصورة وتمكن جيل من البيانات ذات الصلة إحصائيا. قد يكون هذا مفيدا في مقارنة توطين الخلوية في ظل ظروف مختلفة. وعلاوة على ذلك، يتم دمج العنصر الزمني يمكن في المستقبل في نهج نمذجة حركات خلية نخاع العظم، والمزيد من البيانات على الحركة من مختلف أنواع الخلايا في نخاع العظام تصبح متوفرة. ويمكن بعد هذه الطريقة يمكن استخدامها لمحاكاة اضطرابات للنظام، مثل تعبئة الخلايا من نخاع العظم إلى الدورة الدموية، على سبيل المثال، العدلات في حالة وجود التهاب حاد 34. لمزيد من توضيح وظيفة نخاع العظم كمكان لتخزين خلايا الذاكرة المناعية، ويمكن للمرء أيضا تخيل توسيع نطاقه ليشمل نموذج المنافسة على عوامل البقاء على قيد الحياة. أيضا، يمكن تناول الحديث المتبادل محتمل بين محاريب متميزة، فضلا عن تحريض المنافذ. معا، وهذا سوف يساعد على فهم التغيرات الفسيولوجية (على سبيل المثال، يؤدي لسلوك التجدد في الخلايا الجذعية) كما ثالذراع مثل الاضطرابات المرضية للنظام ككل، على سبيل المثال في حالة اضطرابات المناعة الذاتية، والأورام، أو التهاب حاد. كجزء من مفهوم تكرارية من التجربة والنمذجة، ويمكن أن تتولد فرضيات جديدة تقوم على المحاكاة، وهذا بدوره يمكن مرة أخرى أن تختبر تجريبيا، مما يساعد على مزيد من فهم وظيفة والتفاعل من أنواع الخلايا المختلفة داخل تعقيد الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر أندرياس Radbruch لإجراء مناقشات قيمة. ونحن ممتنون لسابين Gruczek، باتريك تيمان ومانويلا Ohde للمساعدة في رعاية الحيوان وروبرت غونتر للحصول على مساعدة فنية ممتازة. نشكر المقيمون لدينا مدربين لورا Oehme، Jannike بيات-سرمدي، كارولين بولوك، كاترين روث، فلورنسا Pache وكاتارينا القرن لتقييم عينات الأنسجة وراندي ليندكويست لتصحيح التجارب المطبعية للمخطوطة. نشكر J. وN. لي، مايو كلينيك، سكوتسديل بولاية أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية عن الأجسام المضادة MBP محددة.
وأيد هذا العمل من قبل DFG HA5354 / 4-1، قبل JIMI-منحة الشبكة منشأة DFG الأساسية لintravital المجهري وTRR130 / TP17، وDFG FOR 2165 (HA5354 / 6-1) لAEHSZ كان مدعوما من ماكس بلانك الدولية مدرسة للأمراض المعدية والمناعة (IMPRS-IDI)، برلين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al.
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E.
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
