السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
الحصين يلعب دورا هاما في الذاكرة والتعلم وكذلك السلوك العاطفي. وتتكون واحدة تتمثل المهمة الرئيسية للتوحيد الذاكرة القصيرة الأمد إلى ذاكرة طويلة الأمد، الأمر الذي يتطلب مرونة عالية في الجهاز العصبي. التلفيف المسنن من الحصين بمثابة بوابة رئيسية لإدخال المعلومات وهي أيضا واحدة من مناطق الدماغ مع اثنين من تكوين الخلايا العصبية المستمر طوال فترة البلوغ 1،2. تطوير البنية الحصين يحدث خلال أواخر مرحلة التطور الجنيني وخاصة خلال أول 3 إلى 4 أسابيع بعد الولادة 3. خلال التنمية في وقت مبكر من التلفيف المسنن يتم تأسيس تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لبعد الولادة وكذلك تكوين الخلايا العصبية الكبار 4. الخلايا العصبية تطوير تمر عبر مراحل مختلفة، من الخلايا الجذعية من خلال عدة مراحل من الخلايا الاصلية لغير ناضجة، وأخيرا الخلايا العصبية الناضجة خلال بعد الولادة، فضلا عن تكوين الخلايا العصبية الكبار. في مراحل مختلفة من الخلايا العصبية التعبير عنمطلوب جينات معينة للسماح للنضوج والتكامل من الخلايا العصبية الجديدة في قرن آمون الدوائر 5،6.
باستخدام الماوس علم الوراثة وتحليل النمط الظاهري من قبل المناعية وكذلك الأساليب الجزيئية يسمح تحديد نمط التعبير وظيفة العديد من هذه الجينات. وبالإضافة إلى ذلك تحليل ميكروأري وكذلك مناعي لونين (رقاقة) قدمت معلومات عن الجينات المحتملة المباشرة وغير المباشرة المستهدفة 7،8. ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن الآليات التنظيمية للتنمية قرن آمون، وخاصة تطوير التلفيف المسنن. للحصول على مزيد من التبصر كيف يتم تنظيم الجينات المحددة نظاما مطلوب والسماح للتلاعب من عدد صغير من الخلايا أسفل-أو ما يصل التنظيم من الجين من الفائدة و / أو الجينات المستهدفة ومتابعة مصيرهم خلال التنمية. في الرحم Electroporation لل من shRNAs، كدنا] من الجينات في المصالح أو لجنة المساواة العرقية recombinaتوفر حد ذاتها مثل هذه الأداة. لضمان وجود الحمض النووي المطلوب أو الرنا صغيرة البلازميدات التعبير ينبغي أن تستخدم ل electroporation. ويتم تنفيذ هذا النهج بنجاح كبير في دراسة تطوير القشرية 9،10، ولكن هو نهج أكثر تحديا دراسة تطوير التلفيف المسنن بسبب الموقف من الهياكل قرن آمون في الدماغ طبقات أعمق.
السابقين الرحم بعد Electroporation للثقافة شريحة عضوي النمط هو نهج واحد للتحايل على هذه المشكلة 11،12. وعلى النقيض من في الرحم Electroporation لللا الجنين كله ولكن فقط الرأس ويستخدم يسمح بالتالي لوضع الأقطاب الكهربائية بطريقة أكثر ملاءمة لتوجيه shRNA / DNA نحو الحصين والتلفيف المسنن. مجموعتنا يعمل بنجاح السابق الرحم Electroporation لللدراسة دور عامل النسخ Bcl11b خلال تطوير التلفيف المسنن 8. Bcl11b لها دور مزدوج في التنمية التلفيف المسنن التي كتبها regulating السلف تكاثر الخلايا وكذلك التمايز كما يتضح من المناعية. لزيادة تحديد آلية لمشاركة Bcl11b في هذه العمليات، تم تعديل بروتوكولات للمجموعة Polleux 11،12 لدراسة التلفيف المسنن كما هو موضح أدناه في قسم البروتوكول. في النهج الأول تم تناول مسألة ما إذا كان Bcl11b وتنظيم الخلايا العصبية خلية تمايز الخلايا بشكل مستقل. فحص والنهج الثاني سواء Desmoplakin، جين هدفا مباشرا للBcl11b، كافية لانقاذ النمط الظاهري Bcl11b.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحصين له وظيفة هامة في التعلم والذاكرة. التلفيف المسنن هي أيضا واحدة من منطقتين في الدماغ حيث يحدث تكوين الخلايا العصبية، ليس فقط خلال تطوير ولكن أيضا في جميع أنحاء مرحلة البلوغ. بعد الولادة والكبار عائدات تكوين الخلايا العصبية قرن آمون بطريقة مماثلة تنطوي على العد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
