Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
De hippocampus speelt een belangrijke rol in het geheugen en het leren evenals emotioneel gedrag. Een hoofdfunctie bestaat uit de consolidatie van kortetermijngeheugen in lange termijn geheugen, die een hoge plasticiteit van het zenuwstelsel vereist. De dentate gyrus van de hippocampus treedt op als eerste gateway voor ingangsinformatie en is één van twee hersengebieden met voortdurende neurogenese volwassen leeftijd 1,2. De ontwikkeling van de hippocampus constructie optreedt tijdens de late embryogenese en vooral tijdens de eerste 3-4 weken postnatale 3. Tijdens de vroege ontwikkeling van de gyrus dentatus een stamcel zwembad gevestigd is, is vereist voor postnatale evenals volwassen neurogenese 4. Het ontwikkelen van neuronen passeren verschillende stadia, van de stamcel door verschillende stadia van voorlopercellen naar het onvolwassen en tenslotte de volwassen neuron tijdens postnatale evenals volwassen neurogenese. In verschillende stadia van de expressie van neurogenesespecifieke genen is vereist om de rijping en integratie van nieuwe neuronen in de hippocampus circuits 5,6 toe.
Met muisgenetica en fenotype analyse met immunohistochemie en moleculaire methoden toegestaan definieert het expressiepatroon en functie van vele van deze genen. Daarnaast microarray analyse als chromatine immunoprecipitatie (chip) verstrekt informatie over mogelijke directe en indirecte targetgenen 7,8. Echter, er zijn nog veel open vragen met betrekking tot de regulerende mechanismen van de hippocampus ontwikkeling, met name de ontwikkeling van de dentate gyrus. Om verder inzicht hoe specifieke genen worden gereguleerd een systeem nodig waarmee de manipulatie van een klein aantal cellen krijgen door neerwaartse of opwaartse regulatie van het gen van interesse en / of de doelwitgenen en volgen hun lot tijdens de ontwikkeling. In utero elektroporatie van shRNAs, cDNA van genen van belang of Cre recombinase biedt een dergelijk instrument. Om de aanwezigheid van het gewenste DNA of kleine RNA expressie plasmiden worden gebruikt voor elektroporatie waarborgen. Deze benadering is zeer succesvol geïmplementeerd bestuderen Corticale 9,10, maar is moeilijker benadering waarin de ontwikkeling van de dentate gyrus door de positie van de hippocampale structuren in diepere lagen hersenen.
Ex utero elektroporatie gevolgd door organotypische slice cultuur is een aanpak van dit probleem 11,12 omzeilen. In tegenstelling tot in de baarmoeder elektroporatie niet het hele embryo, maar alleen het hoofd wordt gebruikt waardoor dus de elektroden te plaatsen in een gunstiger manier om direct de shRNA / DNA in de richting van de hippocampus en dentate gyrus. Onze groep succes toegepast ex utero elektroporatie om de rol van de transcriptiefactor Bcl11b bestuderen tijdens dentate gyrus ontwikkeling 8. Bcl11b heeft een dubbele rol in de gyrus dentatus ontwikkeling door regulating voorlopercellen celproliferatie evenals differentiatie zoals werd aangetoond door immunohistochemie. Een mechanisme voor Bcl11b betrokkenheid bij deze processen verder te definiëren, werden protocollen van de Polleux groep 11,12 aangepast aan de dentate gyrus zoals hieronder beschreven in de paragraaf protocol bestuderen. In een eerste benadering werd de vraag aan bod of Bcl11b is het reguleren van neuronale celdifferentiatie cel autonoom. Een tweede benadering onderzocht of Desmoplakine een direct doelwit gen Bcl11b, is voldoende om de Bcl11b fenotype te redden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hippocampus is een belangrijke functie bij het leren en het geheugen. De dentate gyrus is één van twee hersengebieden waar neurogenese treedt niet alleen tijdens de ontwikkeling, maar ook op volwassen leeftijd. Postnatale en volwassen hippocampale neurogenese verloopt op soortgelijke wijze waarbij veel gemeenschappelijke kenmerken. Het definiëren van de regulerende mechanismen van deze factoren zal zeer nuttig zijn bij het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten, die op zijn beurt zal leiden tot nieuwe therapieë…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
