ויזואליזציה של<em> Streptococcus pneumoniae</em> בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר
Summary
Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Abstract
במהלך בקטרמיה Streptococcus pneumoniae יכול translocate פני האנדותל של כלי הדם לשריר הלב ויוצר פגיעות מלאות חיידקים דיסקרטיים מיקרוסקופיות (microlesions) כי הם ראויים לציון בשל היעדר חדירת תאי מערכת חיסון. בשל שחרורם של מוצרי cardiotoxic, S. pneumoniae בתוך microlesions הם חשבו לתרום לאי ספיקת הלב שלעתים קרובות נצפתה במהלך המחלה דלקת ריאות פולשנית רועמת במבוגרים. מסמך זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לזיהום עכבר ניסיוני שמוביל להיווצרות לשחזור microlesion לב בתוך 30 שעות. הדרכה ניתנת על זיהוי microlesion בhematoxylin & Eosin חלקי לב מוכתמים והבחנות מורפולוגיות בין microlesions המוקדם והמאוחר מודגשים. הדרכה ניתנת על פרוטוקול לאימות של ס ' pneumoniae בתוך microlesions באמצעות נוגדנים נגד פוליסכריד קופסית דלקת ריאות ומיקרוסקופיה immunofluorescent. אחרון, פרוטוקול להתערבות אנטיביוטי שמציל עכברים נגועים ולזיהוי וההערכה של היווצרות צלקת בלבם של עכברי הבראה מסופק. יחד, פרוטוקולים אלה יקלו על החקירה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס פלישת דלקת ריאות לב, מות cardiomyocyte, שיפוץ לב כתוצאה מחשיפה לS. pneumoniae, ואת התגובה החיסונית לpneumococci בלב.
Introduction
אשפוז של מבוגרים לנרכשו בקהילת דלקת ריאות (CAP) נושא סיכונים מתועדים לאירועים לבביים שליליים שתורמים לתמותה 1-4. במחקר שנערך לאחרונה על ידי אל-המדינה קוראלס et. סיבוכים לבביים נמצאו להיות קשורים ו / או אחראי למותם של 27% הקשורים לדלקת ריאות 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), הגורם השכיח ביותר של CAP ואלח דם 5, נקשר ישירות עם אירועים לבביים שליליים בכמה ש-19% מהחולים מבוגרים הודה 6. אירועים לבביים חמורים הקשורים לדלקת ריאות כוללים כישלון חדש או הורע ספיקת לב, הפרעות קצב, ואוטם שריר לב כדי להקטין תדירות של 6.
במאמר פתוגנים PLoS האחרון על ידי אל בראון ואח., S. pneumoniae נמצא מסוגל טרנסלוקציה דרך האנדותל של כלי דם של הלב, הכניסה לmyocardiuמ ', והיווצרותם של הנגעים דיסקרטיים שאינם מוגלתיים מיקרוסקופיים (microlesions) מלאים בחיידקים בחדרי הלב במהלך מחלה פולשנית דלקת ריאות (IPD) 7. עדות להיווצרות microlesion לב נצפתה בדגימות לב מפרימטים שאינם בני אדם ואנשים שנכנעו לזיהום דלקת ריאות. כמו כן, עכברים נגועים בניסוי reproducibly פיתחו microlesions לב. בעכברים, גודל microlesion ומספר היה מתואם חיובי עם המשך והחומרה של בקטרמיה, רמות טרופונין הלבבי בסרום, וelectrophysiology לב חריג. טרנסלוקציה חיידקים ללב נמצאה להתרחש דרך אותם המנגנונים אחראים לטרנסלוקציה של pneumococcus פני מחסום דם-המוח וההתפתחות של דלקת קרום מוח דלקת ריאות, כלומר הפלישה, חלבון קושר כולין בתיווך של תאי האנדותל של כלי דם בקולט Laminin וטסיות דם אופן תלוי הקולטן לגורם -activating 8. Microlesהיווצרות היון נדרשה גם pneumolysin רעלן דלקת ריאות יוצרים הנקבובית שנמצא להרוג cardiomyocytes 7.
microlesions לב דלקת ריאות נבדלים ממוגלתיות רקמות רכות ומורסות לב שנגרמות על ידי חיידקים גראם-חיובי אחרים, כולל Staphylococcus aureus. אלו מאופיינים במוקדים בודדים של חיידקים מוקפים נויטרופילים ו9,10 תצהיר הפיברין. Microlesions שהוקם על ידי ס ' pneumoniae הם קטנים בגודל, בפריסה לב מושפע, וחסר מחלחל תא חיסון. בשלבים המוקדמים של זיהום השלבים, microlesions נגרמים על ידי ס ' pneumoniae מופיע כאזורי של רקמה פגועה או מודלקת מזכירה את הסימנים פתולוגיים של cardiomyopathy. מונוציטים מסוימים עשויים להיות שנצפו בתקופה זו, אך נוכחותם היא קצרה מועד ונגעים הפכו במהירות נימקי במראה ומלא בחיידקים ובמקביל ממשיך משויףow בגודל עד מותו של בעלי החיים או התערבות מיקרוביאלית. חשוב לציין, בתוך 3 ימים של התערבות אנטיביוטיקה, חדירת תאי מערכת חיסון פזרני הוא ציין באתר הנגע לשעבר וזה מלווה בתצהיר קולגן חזק. שיפוץ לב דומה דווח להתרחש בעקבות אוטם יחד עם השלכות ארוכות טווח על תפקוד לב 11-15. לפיכך, microlesions מהווה הסבר אפשרי לאירועים הלבביים השלילי המתרחשים במהלך IPD ואולי השכיחות המוגברת של תמותה הקשורה ללב באנשי הבראה ששרדו את פרק המחלה.
במסמך זה, הוראה מסופקת על מודל העכבר הניסיוני של IPD והיווצרות נגע לב ויזואליזציה של microlesions לב בזיהום המוקדם ומאוחר שלבים. הפרוטוקול לזיהוי של תצהיר קולגן בבעלי חיים שנשמרו על ידי התערבות מיקרוביאלית הפגין. המטרה של מאמר זה היא facilitate המחקר של חוקרים אחרים על פתולוגיה דלקת ריאות החשובה והרומן הזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדוח זה, שיטה לשחזור מאוד כדי לגרום לS. pneumoniae תיווך microlesions לב בעכברים במהלך IPD והטכניקות להדמיה שלהם באו לידי ביטוי. עכברים נגועים במינון של חיידקים שעולה סף של המערכת החיסונית לקבלת אישור, שמוביל לבקטרמיה בדרגה גבוהה, דומה לזו המתרחשת במהלך אלח דם אדם, ומוביל לטר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
